Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) zum Nachweis von Genomic Copy Number Varianten
Summary
Array-CGH für den Nachweis von genomischer Kopienzahl-Varianten hat G-gebändert Karyotypanalyse ersetzt. Dieses Papier beschreibt die Technologie und ihre Anwendung in einem Diagnose-Service-Labor.
Abstract
Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.
Introduction
Es ist seit vielen Jahren, dass Deletionen oder zusätzliche Kopien von Chromosomensegmente verursachen geistiger Behinderung, Dysmorphien und congentical Fehlbildungen bekannt, und in einigen Fällen dazu führen, genetische Syndrome 1. Doch die einzige Technologie zur Verfügung, bis Mitte der 2000er Jahre für die genomweite Erfassung dieser Veränderungen war, G-gebändert Chromosomenanalyse, die eine Auflösung von rund 5-10MB hat, je nach Region und Art des Ungleichgewichts und welche nicht abnorme Chromosomen, wo Material wurde von einer Region aus einem anderen Chromosom mit der gleichen Bandenmuster ersetzt. Neben zytogenetischen Techniken wie Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Multiplex Ligation-spezifischen Sonde Verstärkung wurden für die Abfrage bestimmter Loci vorhanden, bei Verdacht auf bestimmte syndromale Ungleichgewicht, aber es war nicht bis zur Einführung der Array Comparative Genomic Hybridization (Array-CGH) in der klinischen Routinediagnose service 2-5, die genomweite Erfassung der Kopienzahl-Varianten (CNVs) wurde zu einem stark erhöhten Auflösung (typischerweise um 120kb) möglich. Klinische Servicearbeiten neben Studien haben gezeigt, dass CNVs für einige Regionen in der Normalbevölkerung 6-7 weit verbreitet, während andere CNVs, die zuvor nicht nachweisbar, werden mit neurodisabilities wie Autismus und Epilepsie 8-11 verbunden.
Die in diesem Dokument beschriebenen Protokoll wird in unserem UK National Health Service (NHS) klinisch-diagnostischen Labor; wir neuartige Hybridisierung Strategien, Chargenprüfung und Robotik zu Kosten in diesem staatlich finanzierten Dienst minimieren.
Vor dem unten beschriebenen Protokoll sollte hochwertige DNA aus dem entsprechenden Ausgangsmaterial, meist Blut, kultivierten Zellen oder Gewebeproben entnommen werden. Spektrophotometrie verwendet werden, um Konzentration zu messen (sollte> 50 ng / ul) und prüfen 260: 280 Absorptionsverhältnisse (zu be von 1,8 bis 2,0). Die Gelelektrophorese kann kontrolliert werden, dass die DNA mit hohem Molekulargewicht ohne signifikanten Abbau werden.
Dieses Protokoll wird für einen höheren Durchsatz Laboratorien, Kennzeichnung 96 Proben pro Lauf mit automatisierten Liquid-Handling-Robotik sollen. Es kann jedoch für niedrigere Durch Labors ohne Automatisierung angepaßt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Array-CGH wird ausgewogenen Umlagerungen oder Ploidie Anomalien wie Triploidie nicht erkennen. Ferner können geringe mosaic Ungleichgewichte nicht erkannt werden. Hat Array-CGH jedoch eine höhere Auflösung für CNV Erkennung als G-gebändert Chromosomenanalyse, die es in vielen Labors Zytogenetik ersetzt hat. Es ist daher der derzeitige Goldstandard für die genomweite CNV-Erkennung. Sie kann von der nächsten Generation Sequenziertechnologien in der Zukunft ersetzt werden, aber derzeit, ihre Kosten und die technisch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
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