מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים
Summary
Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.
Abstract
Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.
Introduction
מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ.
שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ"א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes 1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה.
בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים 3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ"א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש ב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
| 10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
| NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
| ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
| bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Scientific | 17919 | Fisher Scientific |
| 40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
| Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
| 10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
| benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
| [α-32P] ATP (3000 Ci/mmol) | PerkinElmer | BLU003H250UC | |
| dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
| Equipment | Company | ||
| PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
| Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
| lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
| Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
| 3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
| Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
| ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
| TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
| Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
| General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |
References
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
- Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
- Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
- Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
- Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
- Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
- Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
- Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
- Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
- Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
- Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
- Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
- Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
- Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
- Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).
