In Vitro Pancreas organogenesen fra Spredt mus embryonale stamceller

Summary

Den tredimensjonale kulturmetode er beskrevet i denne protokollen sammenfatter pancreas utviklingen fra dispergert embryonale muse bukspyttkjertel progenitorer, inkludert et vesentlig ekspansjon, differensiering og morfogenese i en forgrenet organ. Denne metoden er mottagelig for avbildning, funksjonelle forstyrrelser og manipulering av nisjen.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

Organ kultur gir en nyttig modell som bygger bro over gapet mellom det komplekse, men svært relevant in vivo undersøkelser og praktisk, men omtrentlig simulering av cellelinje modeller. I tilfelle av bukspyttkjertelen, er det ingen cellelinje helt ekvivalent med bukspyttkjertel progenitorer, selv om det er transformert cellelinjer som simulerer endokrine og eksokrine celler. Den voksne hele bukspyttkjertelen kan ikke dyrkes; isolerte endokrine holmer kan opprettholdes for noen uker uten celleproliferasjon og vev skiver kan holdes in vitro for noen timer ^fem. Embryonisk pancreas kultur har vært mye brukt, ikke bare for å studere dens utvikling, men også å undersøke epitel-mesenchymale interaksjoner ^4,6,7, til bilde prosesserer ⁸ eller for kjemisk å påvirke dem ^9. To orgel kultur metoder er i hovedsak brukt: den første består i dyrking bukspyttkjertelen knopper på fibronectin belagte plater ^2, som er betjenesnient for bildebehandling formål; det andre alternativet er å kultur organene på filtre på luft-væske-grensesnittet ^3,4 som beste bevarer morphogenesis. Selv om svært nyttig, er disse fremgangsmåter fører til en viss grad av utflating; ekspansjon av progenitorer er svært begrenset i forhold til den normale utviklingen og det anvendte utgangs populasjonen er kompleks som omfatter alle typer av pankreatiske celler og mesenkymale celler.

Evnen til kultur og utvide spredte primære celler er verdifullt å studere avstamning relasjoner og avdekke de iboende egenskapene til isolerte celletyper ^10. Sugiyama et al ^11. Kunne opprettholde bukspyttkjertelen stamfedre og endokrine stamfedre som beholdt noen funksjonelle tegn for 3-5 dager i kultur på næringslag. Pancreatospheres, beslektet med neurospheres ¹² og mammospheres ^13, har blitt utvidet fra voksne holmer og duktale celler selv om arten av forfedrene / stamcellersom genererer disse sfærene er ikke klart. I tillegg, i motsetning til fysiologisk utvikling, de pancreatospheres inneholdt noen nevroner ^14,15. Spheres ble også nylig produsert fra embryonale bukspyttkjertel progenitors ^16,17 og regenererende pankreata ¹⁸ med god stamfar ekspansjon og påfølgende differensiering, men ikke klarte å rekapitulere morphogenesis.

3D modeller fra spredte og ofte definerte celler som selv-organiserer i miniatyriserte organer nylig har blomstret og simulere utvikling eller voksen omsetning av flere organer som tarmen ^19,20, magen ^21, leveren ^22, prostata ²³ og trakea ^24. I noen tilfeller er utviklingsmessig morfogenese og differensiering blitt rekapitulert i 3D fra ES-celler, som er tilfellet med optiske kopper ^25, tarm ²⁶ eller hjerne ^27..

Her, vi desCribe en metode for å utvide dissosiert multipotent bukspyttkjertelen stamfedre i en 3D Matrigel stillas der de kan differensiere og selv organisere.

Protocol

Denne protokollen tar sikte på å vokse bukspyttkjertelen organoids avledet fra murine E10.5 dissociated epiteliale bukspyttkjertelen celler. Protokollen krever etisk godkjenning for dyreforsøk. En. Disseksjon av Dorsal Bukspyttkjertel Bud fra E10.5 mus embryoer Ofre for tidsbasert gravide mus på embryonale dag (E) 10,5, åpne magen med en saks, fjern de to livmor horn og legg dem i en 10 cm petriskål fylt med kaldt fosfatbuffer saltvann (PBS) elle…

Representative Results

E10.5 rygg bukspyttkjertelen stamfedre dissosiert og seeded i 3D Matrigel rekapitulere bukspyttkjertelen utvikling. Stamfedre kan lettest fulgt med fluorescerende reportere. I vårt tilfelle brukte vi en transgen mus som uttrykker en kjernefysisk GFP protein kontrollert av Pdx1 promoter (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Movie 1) i fravær av tamoxifen og dermed uten å aktivere Neurog3 4 (Figur 2). Med organoid medium, forekommer en innledende k…

Discussion

Storskalaproduksjon av funksjonelle beta-celler in vitro er fortsatt ineffektiv ^1.. I denne utfordrende sammenheng, kan utviklingsbiologi studier hjelpe å tyde den eksakte signaler som kreves for differensiering av funksjonelle betaceller. Denne protokollen tillater opprettholdelse, vekst og differensiering av embryoniske stamceller pankreas in vitro. Dette inkluderer dannelsen av insulin-produserende beta celler som ikke co-express andre endokrine hormoner, har høye nivåer av Pdx1, uttry…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745