De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized
Summary
Voo espacial diagnósticos de sangue precisa de inovação. Poucas manifestações foram publicados ilustrando em voo, tecnologia de diagnóstico de saúde de gravidade reduzida. Aqui apresentamos um método para a construção e operação de um equipamento de teste de vôo parabólico para um projeto protótipo point-of-care citometria de fluxo, com componentes e estratégias de preparação adaptáveis a outras configurações.
Abstract
Até recentemente, as amostras de sangue foram coletadas de astronautas em voo, transportado para terra no ônibus espacial, e analisadas em laboratórios terrestres. Se os seres humanos são a viajar para além da órbita baixa da Terra, a transição para o espaço-pronto, ponto-de-cuidado é necessário (POC) de testes. Este tipo de teste precisa ser abrangente, de fácil execução em um ambiente de gravidade reduzida, e não afetado pelas tensões de lançamento e voo espacial. Inúmeros dispositivos POC foram desenvolvidos para imitar homólogos escala laboratorial, mas a maioria tem aplicações limitadas e poucos têm uso demonstrável em, um ambiente de gravidade reduzida em voo. Na verdade, as manifestações de diagnósticos biomédicos em gravidade reduzida são limitados por completo, fazendo a escolha de componentes e certos desafios logísticos de difícil abordagem quando se pretende testar uma nova tecnologia. Para ajudar a preencher o vazio, estamos apresentando um método modular para a construção e operação de um dispositivo de diagnóstico protótipo do sangue e sua p associadoarabolic equipamento de teste de vôo que cumprir as normas de vôo-teste a bordo de um vôo parabólico, aeronave de gravidade reduzida. O método se concentra primeiro em assembléia plataforma para, testes de gravidade reduzida em voo de um citômetro de fluxo e um chip de mistura microfluídica companheiro. Componentes são adaptáveis a outros projetos e alguns componentes personalizados, tais como um carregador amostra microvolume eo micromisturador pode ser de particular interesse. O método então foco muda para a preparação do voo, oferecendo orientações e sugestões para se preparar para um teste de vôo bem sucedido no que diz respeito ao treinamento do usuário, o desenvolvimento de um procedimento operacional padrão (POP), e outras questões. Finalmente, os procedimentos em voo experimentais específicos para nossas manifestações são descritas.
Introduction
A inadequação dos diagnósticos de saúde atual do espaço do pronto apresenta um fator limitante para a mais profunda exploração espacial tripulada. Diagnóstico precisa ser abrangente e fácil de usar em gravidade reduzida, e relativamente pouco afetado pelas tensões de lançamento e voo espacial (por exemplo, altas forças G, vibração, radiação, mudanças de temperatura e de pressão da cabine alterações). A evolução dos testes point-of-care (POCT) pode se traduzir em soluções eficazes voo espacial através do uso de amostras de pacientes menores (por exemplo, uma picada no dedo), fluídica mais simples e menores (ou seja, microfluidics), e reduziu exigências de energia elétrica, entre outros vantagens. Citometria de fluxo é uma abordagem atractiva para o POC em espaço devido à ampla utilidade da tecnologia, incluindo para contagem de células e quantificação biomarcador, assim como o potencial de miniaturização significativa. Relevante-espaciais anteriores citómetros de fluxo incluem o 'effic embalagem nucleariency '(NPE) instrumento que utilizou fluorescência induzida simultânea arco-lâmpada e volume eletrônico (Coulter volume) de medição 1-4, um relativamente pequeno fluxo de bancada citômetro representando a' primeira geração de fluxo em tempo real de dados de citometria durante gravidade zero "5, um "microflow sheathless citômetro" capaz de 4 e 5-parte de glóbulos brancos (WBC) contagem diferencial utilizando pré-tratados 5 mL de amostras de sangue total de 6-9, e um 'de fibra óptica baseado' citômetro de fluxo recentemente testado a bordo no Internacional Space Station 10.
Avaliando tecnologia de diagnóstico para aplicações espaciais em potencial é normalmente realizada a bordo da aeronave de gravidade reduzida que utilizam uma trajetória de vôo de aproximadamente parabólico para simular um nível escolhido de ausência de peso (por exemplo, de gravidade zero, marciano-gravidade) 11. A avaliação é um desafio, porque oportunidades de voo são limitados, RePetjanelas curtas tivo da microgravidade pode torná-lo difícil de avaliar metodologias ou processos que normalmente requerem períodos ininterruptos com mais de 20-40 segundos, e as manifestações podem exigir equipamentos adicionais que não são facilmente utilizado em voo 12-15. Além disso, as manifestações anteriores do in vitro (IVD) tecnologias de diagnóstico usados em, ou concebidos para reduzir a gravidade são limitados e muito trabalho ainda não publicado. Além dos citómetros de fluxo acima, outros IVD-tecnologias relevantes para o espaço descrito na literatura incluem um dispositivo de toda mancha de sangue para aplicações de imunofenotipagem 16, um baseado em câmera automatizada citômetro 12, um analisador clínico portátil para potenciometria integrado, amperometria, e Conductometria 12,17, um dispositivo de microfluidos 't-sensor de' para a quantificação do analito que se baseia na mistura à base de difusão e de separação 18, e uma rotação 'laboratório num CD' diagnósticos plataforma 19,20. Os recém-chegados aos testes em gravidade reduzida pode também olhar para demonstrações de vôo parabólico não relacionadas com diagnóstico in vitro ao tentar fazer avaliação dispositivo possível (ou descobrir o que é possível). Manifestações de outros experimentação médica ou biológica anterior com a preparação do voo, as estratégias de bordo e equipamentos de teste de vôo documentado estão incluídos na Tabela 1 15, 21-35. Estes podem ser informativo, devido à inclusão de tarefas manuais de bordo, o uso de equipamentos especializados e de contenção experimental.
| Categoria | Exemplos |
| Atendimento médico de emergência | A intubação traqueal (guiado por laringoscópio, em manikem) 21, de suporte de vida cardíaca (porcos anestesiados) 22 |
| O tratamento cirúrgico | A cirurgia laparoscópica (vídeo simulado 23, em porcos anestesiados 24,25) |
| Imagiologia médica ou avaliação fisiologia | O ultra-som com câmara de pressão negativa inferior do corpo 26, fluxômetro Doppler (cabeça montado) 27, monitor de pressão venosa central 28 |
| Equipamento biológico Especializada | Leitor de microplacas (e caixa em voo luva) 29, o sistema de controle de temperatura para os experimentos do ciclo celular, 30 (microscópio de campo claro, contraste de fase e fluorescência multi-canal capaz) 15, capilarunidade de electroforese acoplada ao microscópio vídeo 31 |
| Outro | Colheita das plantas com uma pinça 32, continha 33,34 ratos e peixes 35 para observação |
Tabela 1. parabólica voo de demonstração com exemplos bem descrito Métodos / Experimentos
Para expandir a exemplos anteriores e proporcionar um maior conhecimento sobre bem-sucedidas demonstrações em voo, estamos apresentando um procedimento modular e adaptável para a construção e operação de um protótipo citômetro de fluxo com tecnologia de mistura de microfluídica relacionado como parte de um equipamento de teste de vôo parabólico. O equipamento permite demonstrações de carregamento da amostra, mistura de microfluídica, e detecção de partículas fluorescentes, e foi testado a bordo da NASA Facilitado Access 2010 para o ambiente espacial (FAST) flig parabólicahts, voadas a partir de 29 setembro – 1 outubro de 2010. Estas demonstrações puxar desde o início, meio e fim, respectivamente, de um fluxo de trabalho dispositivo potencial no qual amostras de sangue do tamanho de ponta de dedo-são carregados, diluído ou misturado com reagentes, e analisados por meio óptico detecção. Dimensionamento de um citômetro de fluxo em uma unidade compacta requer inovação e seleção cuidadosa parte. Personalizado e componentes off-the-shelf são usados aqui, escolhido como melhores aproximações iniciais de escolhas componente final, e pode ser adaptável para os projetos de outros inovadores. A seguir um resumo das escolhas de componentes do protótipo, a instalação é descrita em uma estrutura de apoio que serve como um esqueleto para a montagem da sonda. Componentes do protótipo são atribuídos locais, garantido, e acompanhado pelos componentes adicionais necessários para a experimentação bem sucedida. Atenção então muda para procedimentos mais abstratos que envolvem o procedimento padrão de operação (SOP) desenvolvimento, treinamento e outros aspectos logísticos. Finalmente, os procedimentos específicos de demonstração sãodescrito. As estratégias descritas aqui e as escolhas de apoiar os componentes da plataforma (por exemplo, microscópio, caixa de acrílico, etc.), embora implementadas aqui para protótipo específico, falar com as questões gerais e desafios relevantes para testar qualquer equipamento de diagnóstico de sangue em um ambiente de gravidade reduzida .
Nos vôos 2010, dois lunar-gravidade (que atingem cerca de 1/6 terra gravidade) e dois voos de micro-gravidade foram agendadas por 4 dias, embora em última análise, estes foram reprogramadas por 3 dias. Manifestações foram realizadas a bordo de um jato modificado avião privado operado, narrow-body 36. Cada voo desde 30-40 parábolas, cada um produzindo cerca de 20 seg de alta gravidade (aproximadamente 1,8 g), seguido de 20-25 segundos de condições de gravidade reduzida. Depois de metade das parábolas foram executados, o avião fez uma pausa por um período de cerca de 5-10 min em vôo nivelado para permitir que o avião dar meia volta e voltar para o local de pouso enquanto performing o restante das parábolas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui habilitado demonstração efetiva dos principais componentes de tecnologia (de carregamento da amostra, mistura microfluídica e detecção óptica) durante os 2.010 vôos parabólicos da FAST, com resultados comparáveis aos testes em solo. Os métodos de treinamento e SOP aqui descritos foram particularmente eficazes, e ajudou a iluminar ferramentas e outro ser 'muletas' invocado para demonstrações práticas que não estariam disponíveis a bordo do vôo parabólico.
<p clas…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Desenvolvimento de hardware foi apoiada pela NASA SBIR Contratos NNX09CA44C e NNX10CA97C. A análise dos dados para os blocos e carregador amostra manifestações ópticas foi apoiado pela NASA Fase III Contrato NNC11CA04C. A coleta de sangue humano foi realizada utilizando NASA IRB Protocolo # SA-10-008. Software de controle / aquisição fornecido através do Dispositivo Médico Instrumentos Programa Nacional de Grant. Moldes para os microchips foram feitas na instalação de microfabricação Johns Hopkins e do Centro Harvard para sistemas em nanoescala. Otto J. Briner e Lucas Jaffe (Instituto de Medicina DNA) ajudou na montagem do rack durante o verão de 2010. NASA funcionários vídeo voo desde imagens de vídeo durante a semana de vôo. Carlos Barrientos (Instituto de Medicina DNA) prestou assistência fotografia e figura. Um agradecimento especial para o acesso facilitado ao ambiente do espaço de Tecnologia Programa 2010, a gravidade Escritório NASA reduzido, a adaptação humana e Contramedidas Division, NASA Glenn Research Center,ZIN Technologies, e do Programa de Pesquisa em Seres Humanos.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Micro air pump | Smart Products, Inc. | AP-2P02A | Max pressure = 6.76 psi; 1.301” x 0.394” x 0.650” , 0.28 oz (8 g); available direct from Smart Products |
| Differential pressure sensor | Honeywell International, Inc. | ASDX015D44R | Range of 0-15psi; 0.974" x 0.550" x 0.440", 0.09 oz (2.565 g); suppliers include Digi-Key and Mouser Electronics |
| Rigid plastic vial (small size) | Loritz & Associates, Inc. | 55-05 | Polystyrene; ID 0.81" (20.6 mm), IH 2.06" (52.4 mm); available direct from LA Container Inc.; similar product available from Dynalab Corp. |
| Rigid plastic vial (larger size) | Loritz & Associates, Inc. | 55-140 | Polystyrene; ID 1.88" (47.6 mm), IH 3.31" (84.1 mm); available direct from LA Container Inc.; similar product available from Dynalab Corp. |
| latex examination gloves | dynarex corporation | 2337 | Middle finger used for latex diaphragm in fluid source vial. Other brands (e.g., Aurelia ® Vibrant ™) acceptable. |
| Optical glue | Norland Products | NOA 88 | Low outgassing adhesive; available direct from Norland; Also available from Edmund Optics Inc. |
| 3-way solenoid valves | The LEE Company | LHDA0531115H | Gas valves, but can function with liquid; 1.29 " L, 0.28 " D. Discontinued product. Similar products available from The LEE Company. |
| Volumetric water flowmeter | OMEGA Engineering inc. | FLR-1602A | Non-contacting flow rate meter strongly preferred. We recommend SENSIRION LG16 OEM Liquid Flow Sensor for flow rates from nl/min up to 5 ml/min. |
| PCD-mini photon detector | Sensl | PCDMini-00100 | For fluorescence detection; available direct from Sensl |
| Accelerometer | Crossbow Technology, Inc. | CXL02LF3 | 3-demensional force detection. Supplied to DMI by NASA. Similar product available from Vernier Software & Technology, LLC. |
| Stereomicroscope | AmScope | SE305R-AZ-E | |
| CCD Camera | Thorlabs | DCU223C | 1024 x 768 Resolution, Color, USB 2.0; available direct from Thorlabs |
| USB and Trigger Cable (In/Out) for CCD Camera | Thorlabs | CAB-DCU-T1 | Available direct from Thorlabs |
| Microbore tubing | Saint-Gobain Corporation | AAD04103 | Tygon®; ID 0.02", OD 0.06", 500ft, 0.02" wall. Suppliers: VWR, Thermo Fisher Scientific Inc. |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | (Custom) | 0.025" OD, 0.017" ID, 0.500” L, stainless steel tube, type 304, cut, deburred, passivated; enable microbore tubing connections, chip tubing connections |
| Slide clamp | World Precision Instruments, Inc. | 14042 | Available direct from World Precision Instruments |
| Leur adaptor pieces | World Precision Instruments, Inc. | 14011 | Available direct from World Precision Instruments |
| Silicon wafer | Addison Engineering, Inc. | 6" diameter; for SU-8 mold fabrication | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | Supplier: Global Industrial SLP, LLC |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | Supplier: Global Industrial SLP, LLC |
| Needle (23 gauge), bevel tip | Terumo Medical Corporation | NN-2338R | Ultra thin wall; 23G x 1.5"; 22G also usable; suppliers: Careforde, Inc., Port City Medical |
| Dispensing needle (23 gauge), blunt tip | CML Supply | 901-23-100 | 23Gx 1"; available from CML Supply |
| Rotary tool | Robert Bosch Tool Corporation | 1100-01 | Dremel® 1100-01 Stylus™ |
| Cover glass | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-518-105E | Gold Seal™ noncorrosive borosilicate glass; for PDMS chip cover; 24×60 mm; available from Thermo Fisher Scientific, Inc. |
| Vacuum pump | Mountain | MTN8407 | For degassing PDMS; supplier: Ryder System, Inc. |
| Vacuum chamber | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 5311-0250 | Nalgene™ Transparent Polycarbonate; available from Thermo Fisher Scientific, Inc. |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hand magnifier | Mitutoyo | 183-131 | Use in reverse direction to enable viewing at ~15". |
| Ethanol | CAROLINA | 861283 | For chip cleaning. Dilute to 70% using millipore water. |
| Water purification system | Thermo Fisher Scientific, Inc. | D11901 | Available direct from Thermo Fisher Scientific, Inc. |
| Optomechanical translation mounts | Thorlabs | K6X | 6-Axis Kinematic Optic Mount; discontinued product; new product (K6XS) available direct from Thorlabs |
| Laptop | Hewlett-Packard | VP209AV | HP Pavilion Laptop running Windows 7 |
| Laptop tray (spring loaded) | National Products, INC. | RAM-234-3 | RAM Tough-Tray™. Can accommodate 10 to 16 inch wide laptops. |
| USB splitter | Connectland Technology Limited | 3401167 | |
| USB Data Acquisition Cards (8 analog input, 12 digital I/O) | National Instruments | NI USB-6008 | 12-Bit, 10 kS/s Low-Cost Multifunction DAQ |
| USB Data Acquisition Cards (16 analog input, 32 digital I/O) | National Instruments | NI USB-6216 | 16-Bit, 400 kS/s Isolated M Series MIO DAQ, Bus-Powered |
| Control/acquisition Software | National Instruments | LabVIEW 2009 | Custom coded National Instruments (NI) LabVIEW |
| 3D Solid Modeling Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corp. | SolidWorks 2011 | |
| 2D Modeling Software | AUTODESK | AutoCAD LT 2008 | |
| Vertical equipment rack | (NASA provided) | N/A | |
| Solid aluminum optical breadboard | Thorlabs | MB2424 | 24" x 24" x 1/2", 1/4"-20 Taps; available direct from Thorlabs |
| Industrial grade steel and hardener | The J-B Weld Company | J-B Weld Steel Reinforced Epoxy Glue | |
| Micro-hematocrit capillary | Fisher Scientific | 22-362-574 | inner diamter 1.1 to 1.2 mm |
| 1 mL syringes | Henke-Sass, Wolf | 4010.200V0 | NORM-JECT®; supplier: Grainger, Inc. |
| Human red blood cells | Innovative Research | IPLA-WB3 | Tested and found negative by supplier for: HBsAg, HCV, HIV-1, HIV-2, HIV-1Ag or HIV 1-NAT, ALT, and syphilis by FDA-Approved Methods. Because no test methods can guarantee with 100% certainty the absence of an infectious agent, human derived products should be handled as suggested in the U.S. Department of Health and Human Services Manual on BIOSAFETY IN MICROBIOLOGICAL AND BIOMEDICAL LABORATORIES, FOR POTENTIALLY INFECTIOUS HUMAN SERUM OR BLOOD SPECIMENS |
| Phosphate buffered saline concentrate | P5493 | SIGMA | 10x; diluted to 1x |
| Tween | P9416 | SIGMA | TWEEN® 20 |
| Centrifuge | LW Scientific | STRAIGHT8-5K | Swing-Out 8-place Centrifuge. Available through authorized dealers. Other centrifuges available direct from LW Scientific. |
| HD video recorder | Sony | MHS-CM5 | |
| Orange fluorescent nucleic acid stain | Invitrogen | S-11364 | SYTO® 83 Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain. Stored in DMSO solvent. Always wear reccommended Personal Protective Equipment. No special handling advice required. |
| Fluorescent counting beads | Invitrogen | MP 36950 | CountBright™ Absolute Counting Beads. Always wear reccommended Personal Protective Equipment. No special handling advice required. |
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