Une approche a été développée pour identifier les conditions optimales de concentration virale pour des échantillons d’eau de petit volume à l’aide de pointes d’adénovirus humains. Les techniques décrites ici sont utilisées pour identifier les paramètres de concentration d’autres cibles virales et appliquées à l’expérimentation de concentration virale à grande échelle.
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Article de méthode
Une procédure de petit volume pour la concentration virale de l'eau
Dans cet article
Résumé
Résumé
La concentration à petite échelle de virus (volumes d’échantillon de 1 à 10 L, ici simulés avec des échantillons d’eau enrichis de 100 ml) est un moyen efficace et rentable d’identifier les paramètres optimaux pour la concentration de virus. Les virus peuvent être concentrés à partir de l’eau par filtration (électropositive, électronégative, laine de verre ou exclusion de taille), suivie d’une concentration secondaire avec de l’extrait de bœuf pour libérer les virus des surfaces filtrantes, et enfin d’une concentration tertiaire aboutissant à un concentré de virus d’un volume de 5 à 30 ml. Afin d’identifier des procédures de concentration optimales, deux filtres électropositifs différents ont été évalués (un filtre verre/cellulose [1MDS] et un filtre nano-alumine/verre [NanoCeram]), ainsi que différentes techniques de concentration secondaire ; La technique Celite où trois tailles différentes de particules de Celite ont été évaluées (fine, moyenne et grande), suivie d’une comparaison de cette technique avec celle de la méthode de floculation organique établie. Divers additifs d’élution ont également été évalués pour leur capacité à améliorer la libération de particules d’adénovirus (AdV) à partir des surfaces des filtres. Les célites à particules fines ont retrouvé des niveaux similaires d’AdV40 et 41 à ceux de la méthode de floculation organique établie lorsque des pointes virales ont été ajoutées lors de la concentration secondaire. Le filtre en verre/cellulose a récupéré des niveaux plus élevés d’AdV40 et 41, par rapport à celui d’un filtre en nano-alumine/fibre de verre. Bien qu’il ne soit pas statistiquement significatif, l’ajout de 0,1 % d’éluant à l’extrait de bœuf amendé au polyphosphate de sodium a permis de récupérer 10 % plus de particules AdV par rapport à l’extrait de bœuf non amendé.
Introduction
Les virus entériques humains sont importants agents responsables de maladies d'origine hydrique 1-3, mais sont généralement présents en faible nombre dans les eaux environnementales contaminées, ce qui rend leur détection difficile sans concentration. Les procédures utilisées pour concentrer les virus comprennent généralement une étape de filtration, suivie d'une élution filtre et secondaire concentration de l'éluat de filtration. Une procédure de filtration commune se fonde sur l'utilisation de membranes chargées telles que des filtres électropositifs (récemment examinés dans 4,5). Ces filtres reposent sur la capture des virus e....
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Protocole
1. Préparation de la verrerie et de logements de filtre
- Sauf indication contraire, tous les stériliser la verrerie, des boîtiers et des solutions de filtrage à 121 ° C pendant 15 min. Pour assurer la stérilité, couvrir toutes les ouvertures ou les surfaces exposées avec soit une feuille d'aluminium ou de papier de bande sécurisé avant la stérilisation.
- Assembler appareil de filtration en attachant boîtier de filtre (diamètre 47 mm) à une branche latérale L erlenmeyer. Recueillir les filtres nécessaires: diamètre 47 mm filtres à disques électropositifs / électronégatif.
- Préparer 1 L de 1,5% d'extrait de....
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Résultats
Sélection Celite
Trois types de célite différents ont été testés avant la sélection de la meilleure variante performante. Celites avec amende à particules moyennes produites les recouvrements d'adénovirus plus élevés. Utilisation de plus grandes celites a entraîné la diminution des recouvrements à la fois pour AdV40 et 41 (entre 32% -100%) (figure 1). Taux moyens de récupération de l'adénovirus 40 étaient 144% ± 52% (fine), 115% ± 28% (moyenne) et 82% ± 53% cel.......
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Discussion
Filtres électropositifs sont utiles à concentrer virus de l'eau; Cependant, ces filtres peuvent différer dans leur structure et la composition qui pourrait à son tour modifier leur efficacité. Se ajoute à ce problème, les structures et les charges varient capside entre les souches de virus nécessitant des techniques de concentration être adaptés pour assurer une récupération optimale 15. Grâce à des modifications simples des techniques de concentration existants (par exemple, filtres électroposit.......
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Déclarations de divulgation
Pas d’intérêts financiers concurrents.
Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les opinions ou les politiques de l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis. La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux ne constitue pas une approbation ou une recommandation d’utilisation.
Remerciements
Nous tenons à remercier le Dr Nicholas J. Ashbolt et le Dr G. Shay Fout pour leur révision du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Adénovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adénovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Thiosulfate de sodium | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Célites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Préfiltre 47 mm | Millipore Corp. | ||
| Glycine ; | Sigma | 50046-1KG | |
| Polyphosphate de sodium | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsine | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Acide chlorhydrique | Fisher | A481-212 | |
| BBL Extrait de bœuf | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Extrait de bœuf | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Système de PCR en temps réel | ABI | N/A | |
| Boîtier de filtre en acier inoxydable | Millipore Corp. | ||
| Kit d’Extraction d’ADN Sanguin | Qiagen ; | 51104 | |
| MPN EPA | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
Références
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al.
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Réimpressions et autorisations
