जल से वायरल एकाग्रता के लिए एक छोटी मात्रा प्रक्रिया
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
मानव आंतों का वायरस जलजनित रोगों 1-3 की महत्वपूर्ण प्रेरणा का एजेंट कर रहे हैं, लेकिन एकाग्रता के बिना उनके पता लगाने के लिए मुश्किल बना रही है, आम तौर पर दूषित पर्यावरण पानी में कम संख्या में मौजूद हैं। वायरस ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं आमतौर पर फिल्टर eluate की एक निस्पंदन फिल्टर क्षालन द्वारा पीछा कदम है, और माध्यमिक एकाग्रता शामिल हैं। एक आम निस्पंदन प्रक्रिया (हाल ही में 4,5 में समीक्षा) इस तरह के विद्युत धन फिल्टर के रूप में वसूल की झिल्ली के उपयोग पर निर्भर करता है। ये फिल्टर फिल्टर सतह (सकारात्मक आरोप लगाया) और लक्षित वायरस कणों के बीच बातचीत electrostatic का उपयोग कर पानी में निलंबित कर दिया वायरस पर कब्जा करने पर भरोसा करते हैं (नकारात्मक आरोप लगाया)। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं जो दो विद्युत धन फिल्टर इस तकनीक पर भरोसा करते हैं, ग्लास / सेलूलोज और नैनो एल्यूमिना / ग्लास फाइबर फिल्टर। ग्लास / सेल्यूलोज फिल्टर लागत ग्लास / सीई के उपयोग की सीमा जो अप करने के लिए 10 बार नैनो एल्यूमिना / ग्लास फाइबर की है कि कर रहे हैं,दिनचर्या वायरस की निगरानी के लिए llulose फिल्टर। हाल के अध्ययनों से एक सस्ता फिल्टर विकल्प के उपयोग को न्यायोचित ठहरा, मतभेद परिवेश पानी 6,7 से enteroviruses की वसूली में इन दो फिल्टर के बीच नाममात्र हैं यह निष्कर्ष निकाला है। ऐसे ऋणात्मक और कांच ऊन फिल्टर के रूप में अन्य फिल्टर विकल्पों हालांकि, वे या तो स्रोत पानी (ऋणात्मक फिल्टर) के pretreatment की आवश्यकता होती है या (कांच ऊन फिल्टर) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं, अध्ययन किया गया है। वायरस एकाग्रता प्रक्रियाओं के विकास के ज्यादातर पानी से वायरस वसूलियां में सुधार करने के क्रम में प्राथमिक एकाग्रता तकनीक (फिल्टर) के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, वॉल्यूम्स मिली लीटर करने के लिए आम तौर पर एक एल से eluant की मात्रा कम हो जो माध्यमिक एकाग्रता प्रक्रियाओं, भी वायरस वसूलियां 8 पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है।
आंतों का वायरस के माध्यमिक एकाग्रता आमतौर पर ऐसी गोमांस निकालने के कुछ प्रकार के रूप में एक flocculating एजेंट पर निर्भर करता है (जैविक floccuआबादी) या स्किम्ड दूध flocculation 9-12 फिल्टर सतहों से वायरस कणों को दूर करने के लिए। हाल ही में, Celite (ठीक कण) के अलावा के साथ युग्मित गोमांस निकालने का उपयोग कर एक और माध्यमिक एकाग्रता प्रक्रिया एडिनोवायरस, Enterovirus, और Norovirus 8,13,14 उबरने के लिए वादा दिखाया गया है। वायरस है कि कणों में जैविक flocculation विधि के समान सिद्धांतों के तहत Celite एकाग्रता कार्यों के लिए देते हैं और निलंबन समाधान के पीएच बदलकर कणों (floc या Celite) से जारी कर रहे हैं। इन दो माध्यमिक एकाग्रता तकनीकों के बीच तुलना नुकीला एडिनोवायरस (अभिभाषक) प्रकार 40 और 41 8 की वसूली में मूल्यांकन किया गया है। इस अध्ययन में दो माध्यमिक एकाग्रता तकनीक एडिनोवायरस की वसूली में सांख्यिकीय इसी तरह के थे कि संपन्न हुआ। हालांकि, कार्बनिक flocculation विधि एक 30 मिनट की आवश्यकता है। पीएच 3.5 पर ऊष्मायन, Celite तकनीक पीएच 4.0 पर एक छोटी ऊष्मायन (10 मिनट) की आवश्यकता है। जैविक flocculatआयन भी तृतीयक एकाग्रता के दौरान floc कणों इकट्ठा करने के लिए महंगा प्रयोगशाला के उपकरण (सेंट्रीफ्यूज) के उपयोग की आवश्यकता है, इसके विपरीत Celite तकनीक निलंबन से Celite कणों को अलग करने के लिए केवल बुनियादी प्रयोगशाला के उपकरण (निर्वात निस्पंदन) का उपयोग करता है।
फिल्टर और माध्यमिक क्षालन तकनीक के कुछ संयोजन भी वायरस वसूलियां को प्रभावित कर सकते हैं। एक अध्ययन में प्राथमिक (विद्युत धन फिल्टर) के कुछ संयोजन और माध्यमिक एकाग्रता तकनीक (Celite या जैविक flocculation) एडिनोवायरस 13 की वसूली का एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा है कि निष्कर्ष निकाला है। इन निष्कर्षों को इन तकनीकों का उपयोग करते हुए कहा कि जब अनुकूलन बेहतर एक दिया पानी मैट्रिक्स से लक्ष्य वायरस को ठीक करने के क्रम में आवश्यक है सुझाव देते हैं। अनुकूलन कई चर (फिल्टर प्रकार / ब्रांड, पीएच क्षालन समाधान, Celite / जैविक flocculation) मूल्यांकन किया जाएगा, के बाद से कठिन प्रक्रिया कई शोधकर्ताओं के लिए सक्रिय रूप से बचने के लिए एक समय लेने वाली है।
इस S के लिएप्रत्येक वायरस प्रकार एक अद्वितीय कैप्सिड आकृति विज्ञान और विशिष्ट कैप्सिड प्रभारी को प्रदर्शित करता है के बाद से tudy, एक प्रक्रिया है, मुमकिन है नुकीला मानव एडिनोवायरस 40 उपभेदों और 41 का उपयोग कर पानी से वायरस एकाग्रता के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था, एकाग्रता प्रोटोकॉल हर वायरस के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है इष्टतम वायरल वसूली को प्राप्त करने के क्रम में लक्ष्य। 1) विद्युत धन फिल्टर 2 द्वारा पीछा डिस्क) एक माध्यमिक एकाग्रता के रूप में Celite तकनीक बनाम एक स्थापित जैविक flocculation विधि के मूल्यांकन का उपयोग करते हुए नल के पानी में वायरस वसूलियां का मूल्यांकन, और 3) मूल्यांकन: यह अध्ययन अभिभाषक 40 और से 41 एकाग्रता के लिए एक तरीका प्रदान करता है तृतीयक एकाग्रता के लिए क्षालन बफ़र्स।
Protocol
Representative Results
Discussion
विद्युत धन फिल्टर पानी से वायरस ध्यान केंद्रित करने में उपयोगी होते हैं; हालांकि इन फिल्टर बदले में उनकी प्रभावशीलता को बदल सकता है जो उनकी संरचना और संरचना में अलग कर सकते हैं। इस समस्या को और जटिल, कै?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. . Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. . ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
