Et lite volum Prosedyre for Viral Konsentrasjon fra Water
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
Menneskelige enteriske virus er viktige utløsende agenter for vannbårne sykdommer 1-3, men er generelt til stede i lave tall i forurenset miljø farvann, noe som gjør deteksjon deres vanskelig uten konsentrasjon. Fremgangsmåtene anvendt for å konsentrere virus typisk omfatte et filtreringstrinn, etterfulgt av filter eluering, og sekundære konsentrasjon av filter eluat. En vanlig filtrering prosedyre er avhengig av bruk av ladede membraner som elektropositive filtre (nylig anmeldt i 4,5). Disse filtrene er avhengige av å fange virus suspendert i vann ved hjelp av elektrostatiske interaksjoner mellom filterflaten (positivt ladet), og målrettede viruspartikler (negativt ladet). To elektropositive filtre som er kommersielt tilgjengelig stole på denne teknologien, de glass / cellulose og nano-alumina / glassfiberfiltre. De glass / cellulose filter kostnadene er opptil 10 ganger så stort som i nano-alumina / glassfiber, som begrenser bruken av glass / cellulose filtre for rutine virus overvåking. Nyere studier har konkludert forskjellene er nominell mellom disse to filtre i utvinningen av enterovirus fra ambient vann 6,7, forklarer bruken av et billigere filter alternativ. Andre filteret slik som elektronegative og glass-ull filtre har vært undersøkt, men de krever enten forbehandling av kilde vann (elektrofiltre) eller ikke er kommersielt tilgjengelige (glass-ull filter). Utviklingen av viruskonsentrasjons prosedyrer har hovedsakelig fokusert på å optimalisere primære konsentrasjonsteknikker (filtre) for å bedre virus inngang fra vann. Men sekundære konsentrasjons prosedyrer, som reduserer volumet av elueringsmiddel vanligvis fra en L til milliliter volumer, kan også ha en betydelig innvirkning på virus inngang 8.
Sekundær konsentrasjon av enteriske virus avhenger typisk av et flokkulerende middel, så som noen typer kjøttekstrakt (organisk floccuning) eller skummet melk flokkulering 9-12 for å fjerne viruspartikler fra filterflater. Nylig har en annen sekundær-konsentrasjonen Fremgangsmåten ved bruk av biff-ekstrakt kombinert med tilsetning av celitt (fine partikler) vist seg lovende for gjenvinning av adenovirus, enterovirus, og norovirus 8,13,14. Celite konsentrasjons arbeider under lignende måte som den for den organiske flokkuleringsmetoden ved at viruspartiklene fester seg til, og blir frigjort fra partiklene (flokkulat eller celitt) ved å endre pH-verdien i suspensjonen løsning. Sammenligninger mellom disse to sekundære konsentrasjons teknikker har blitt evaluert i utvinningen av piggete adenovirus (AdV) typene 40 og 41 8. Denne studien konkluderte med at de to sekundære konsentrasjonsteknikker var statistisk lik i utvinningen av adenovirus. Imidlertid, den organiske flokkulering metoden krever en 30 min. inkubering ved pH 3,5, mens celitt teknikken krever en kortere inkubasjon (10 min) ved pH 4,0. Den organiske flocculation krever også anvendelse av kostbart laboratorieutstyr (sentrifuger) for å samle flokkulatsentre partikler under tertiært konsentrasjon på celitt teknikk i motsetning bare bruker enkel laboratorieutstyr (vakuumfiltrering) for å separere celit-partikler fra suspensjonen.
Visse kombinasjoner av filtre og sekundære elueringsmetoder kan også påvirke virus inngang. En studie konkluderte med at visse kombinasjoner av primære (elektropositive filtre) og sekundære konsentrasjonsteknikker (Celite eller organisk flokkulering) hadde en betydelig innvirkning på utvinning av adenovirus 13. Disse funnene tyder på at en optimalisering er nødvendig for optimalt å gjenvinne target-virus fra en gitt vannmassen ved hjelp av disse teknikkene. Optimalisering er en tidkrevende, krevende prosess mange forskere aktivt unngå siden mange variabler vil bli evaluert (filtertype / merkevare, pH elueringsoppløsning, celitt / organisk flokkulering).
For denne study, en prosedyre ble utviklet for å identifisere optimale forhold for virus konsentrasjon fra vann ved hjelp av piggete menneskelige adenovirus stammer som 40 og 41. Antagelig siden hver virus type viser en unik capsid morfologi og spesifikk capsid kostnad, kan konsentrasjonsprotokoller må være optimalisert for alle virus målrette for å oppnå optimal viral utvinning. Denne undersøkelsen gir en tilnærming for AdV 40 og 41 konsentrering ved: 1) å evaluere virusgjenvinninger i springvann ved hjelp av elektropositive filterskiver, etterfulgt av 2) evaluering av en etablert organisk flokkuleringsmetoden versus celitt teknikken som en sekundær konsentrasjon, og 3) evaluering av elueringsbuffere for høyere konsentrasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektropositive filtre er nyttige i å konsentrere virus fra vann; men disse filtre kan variere i deres struktur og sammensetning som i sin tur kunne forandre deres effektivitet. Compounding dette problemet, kapsidbindende strukturer og kostnadene varierer mellom virusstammer som krever konsentrasjon teknikker skreddersys for å sikre optimal utvinning 15. Gjennom enkle modifikasjoner av eksisterende konsentrasjonsteknikker (f.eks elektropositive filtre, kjøttekstrakt elusjonstester), mer effektiv k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. . Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. . ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
