Малый Порядок громкости для концентрации вируса из воды
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
Человека кишечные вирусы являются важными возбудителями заболеваний, переносимых водой 1-3, но, как правило, присутствуют в небольших количествах в загрязненных вод окружающей среды, что делает их обнаружение трудно без концентрации. Процедуры, используемые, чтобы сконцентрироваться вирусы, как правило, включать в себя стадию фильтрации с последующим элюированием фильтра, и вторичную концентрацию фильтра элюата. Общая процедура фильтрации основан на использовании заряженных мембран, таких как электроположительных фильтров (недавно рассмотренных в 4,5). Эти фильтры полагаться на захвате вирусы, взвешенные в воде, используя электростатические взаимодействия между поверхностью фильтра (положительно заряженных) и целевых вирусных частиц (отрицательно заряженных). Два электроположительные фильтры, которые имеются в продаже полагаться на эту технологию, стекло / целлюлоза и нано-оксид алюминия / фильтры из стекловолокна. Стоимость фильтр стекло / целлюлозу до 10 раз больше, чем / стекловолокна нано-оксида алюминия, которые ограничивают использование стеклянной / CEllulose фильтры для рутинного мониторинга вируса. Недавние исследования пришли к выводу, различия являются номинальными между этими двумя фильтрами в восстановлении энтеровирусов из воды в окружающей среде 6,7, оправдывая использование более дешевой альтернативой фильтра. Другие опции фильтра, такие как электроотрицательных и стекло ваты фильтров были изучены, однако, они либо требуют предварительной обработки исходной воды (электроотрицательные фильтров) или нет в продаже (стекло вата фильтры). Разработка процедур концентрации вируса в основном сосредоточена на оптимизации методов первичных концентрации (фильтры), чтобы улучшить вирусов извлечения из воды. Тем не менее, процедуры вторичные концентрации, которые снижают объем элюента обычно от 1 л до миллилитр объемы, также могут оказать существенное влияние на вирус извлечения 8.
Вторичный концентрации кишечных вирусов, как правило, зависит от флокулянта, например, некоторых видов мясного экстракта (органической floccuтельства) или обезжиренное молоко флокуляции 9-12, чтобы удалить вирусные частицы с поверхности фильтра. Недавно одна процедура вторичного содержание мясного экстракта с использованием в сочетании с добавлением целит (мелких частиц) показал перспективы для восстановления аденовируса, энтеровирус, и Norovirus 8,13,14. Целит концентрации работает под тем же принципам, что входили в органический метод флокуляции в этом вирусных частиц прикрепляются и освобождаются от частиц (хлопьев или целит) путем изменения рН раствора суспензии. Сравнения между этими двумя вторичными методами концентрации были оценены в восстановлении шипами аденовируса (ADV) типов 40 и 41 8. Это исследование показало, что две вторичные методы концентрации были статистически похожи восстановления аденовирусов. Тем не менее, метод органического флокул требует 30 мин. инкубации при рН 3,5, в то время как технология целит требует более короткого инкубации (10 мин) при рН 4,0. Органический flocculatионов и требует использования дорогостоящего лабораторного оборудования (центрифуг), чтобы собрать частицы хлопьев при концентрации третичного, техника целит в отличие использует только основной лабораторное оборудование (вакуумной фильтрации), чтобы отделить целит частиц из суспензии.
Определенные комбинации фильтров и вторичных методов элюирования может также повлиять на вирусные восстановления. Один исследование показало, что определенные комбинации первичных (электроположительных фильтров) и вторичных методов концентрации (целит или органический флокуляции) оказали значительное влияние на восстановление аденовируса 13. Эти данные свидетельствуют о том, что оптимизация требуется для того, чтобы оптимально восстановить целевой вирус из данного водного матрицы при использовании этих методов. Оптимизация затрат времени, трудоемкий процесс многие исследователи активно избегают, так как многочисленные переменные будут оценены (тип фильтра / бренда, рН раствора элюции, целит / органического флокуляции).
Для этого ˘STudy, была разработана процедура, чтобы определить оптимальные условия для концентрации вируса из воды с помощью шипами аденовируса человека штаммов 40 и 41. По-видимому, так как каждый тип вируса отображает уникальный капсида морфологию и удельную капсида заряд, протоколы концентрации возможно, должны быть оптимизированы для каждого вируса цели в целях достижения оптимального вирусного выздоровления. Это исследование представляет собой подход к AdV 40 и 41 концентрирования: 1) оценка вирусных извлечения в водопроводной воде с использованием электроположительных диски фильтра с последующим 2) оценка установленном органического метода флокуляции по сравнению с техникой целит в качестве вторичного концентрации и 3) оценки элюции буфера для высшего концентрации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Электроположительные фильтры могут быть использованы в концентрации вирусов из воды; Однако эти фильтры могут отличаться по своей структуре и композиции, которая, в свою очередь изменяют их эффективность. Усугубляет эту проблему, капсида структуры и сборы варьироваться в зависимости…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. . Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. . ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
