En liten volym Förfarande för Viral Koncentration från Water
Summary
An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.
Abstract
Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.
Introduction
Mänskliga enter virus är viktiga smittämnen vattenburna sjukdomar 1-3, men är i allmänhet närvarande i lågt antal i förorenade miljö vatten, vilket gör deras upptäckt svårt utan koncentration. Förfaranden som används för att koncentrera virus innefattar typiskt ett filtreringssteg, följt av filter eluering, och sekundär koncentration av filter eluatet. En vanlig filtreringsförfarande bygger på användning av laddade membran såsom elektrofilter (nyligen granskats i 4,5). Dessa filter är beroende av att fånga virus suspenderade i vatten med hjälp av elektrostatiska interaktioner mellan filterytan (positivt laddade) och riktade viruspartiklar (negativt laddade). Två elektrofilter som är kommersiellt tillgängliga förlita sig på denna teknik, glas / cellulosa och nanoaluminiumoxid / glasfiberfilter. De glas / cellulosa filterkostnader är upp till 10 gånger den nanoaluminiumoxid / glasfiber, som begränsar användningen av glas / cellulose filter för rutinövervakning virus. Nya studier har ingått skillnader är nominella mellan dessa två filter i återvinning av enterovirus från omgivande vatten 6,7, motiverar användningen av ett billigare filteralternativ. Andra filteralternativ såsom elektro och glasull filter har studerats, men de kräver antingen förbehandling av käll vatten (elektrofilter) eller inte är kommersiellt tillgängliga (glasull filter). Utvecklingen av förfaranden viruskoncentrations har främst fokuserat på att optimera primära koncentrationstekniker (filter) för att förbättra virusåtervinningar från vatten. Men sekundära koncentrationsförfaranden, som minskar volymen av elueringsmedlet typiskt från 1 L för att milliliter volymer, kan också ha en betydande inverkan på virus återvinningar 8.
Sekundär koncentration av enter virus bygger vanligtvis på ett flockningsmedel, såsom vissa typer av nötkött extrakt (organisk floccuning) eller skummjölk flock 9-12 för att ta bort viruspartiklar från filterytor. Nyligen har en annan sekundär procedur koncentration med användning av köttextrakt i kombination med tillsats av Celite (fin partikel) visat lovande för utvinning adenovirus, enterovirus, och norovirus 8,13,14. Celite koncentrations verk enligt liknande principer till den för den organiska flockningsmetod genom att viruspartiklar fäster till och frisätts från partiklar (flock eller celit) genom att förändra pH suspensionslösning. Jämförelser mellan dessa två sekundära tekniker koncentrations har utvärderats i återvinning av spetsade adenovirus (ADV) typerna 40 och 41 8. Slutsatsen Denna studie att de två sekundära tekniker koncentrations var statistiskt lika i återvinning av adenovirus. Emellertid kräver det organiska flockningsmetod en 30 min. inkubation vid pH 3,5, medan den celit teknik kräver en kortare inkubering (10 min) vid pH 4,0. Den organiska flocculatjon kräver också användningen av dyra laboratorieutrustning (centrifuger) för att samla flock partiklar under tertiär koncentration, den Celite tekniken däremot använder bara grundläggande laboratorieutrustning (vakuumfiltrering) för att separera Celite partiklar från fjädring.
Vissa kombinationer av filter och sekundära elueringstekniker kan också påverka virusåtervinningar. En studie kom fram till att vissa kombinationer av primära (elektrofilter) och sekundära koncentrationstekniker (Celite eller organiskt flock) haft en betydande inverkan på återvinning av adenovirus 13. Dessa resultat tyder på att optimeringen krävs för att optimalt återhämta mål virus från en given vattenmatris när du använder dessa tekniker. Optimering är en tidskrävande, mödosam process många forskare undviker aktivt sedan flera variabler kommer att utvärderas (filtertyp / varumärke, pH elueringslösning, celit / organisk flock).
För denna sTudy, var ett förfarande utvecklats för att identifiera optimala förhållanden för viruskoncentration från vatten med hjälp av spetsade humant adenovirus stammar 40 och 41. Förmodligen eftersom varje virustyp visar en unik kapsid morfologi och specifik kapsid laddning, kan protokoll koncentrations måste optimeras för varje virus rikta för att uppnå optimal viral återhämtning. Denna studie ger en metod för AdV 40 och 41 koncentration genom: 1) utvärdera virusåtervinningar i kranvatten med hjälp elektrofilterskivor följt av 2) utvärdering av en etablerad organisk flockmetod kontra celit tekniken som en sekundär koncentration, och 3) utvärdering av elueringsbuffertar för tertiär koncentration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektrofilter är användbara koncentrera virus från vatten; emellertid dessa filter kan skilja sig i sin struktur och sammansättning, eventuellt i sin tur ändrar deras effektivitet. Compounding detta problem, kapsid strukturer och avgifter varierar mellan virusstammar som kräver koncentrationstekniker skräddarsys för att säkerställa optimal återhämtning 15. Genom enkla modifieringar av befintliga koncentrationstekniker (t.ex. elektrofilter, köttextrakt eluering), mer effektiv koncentratio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. . Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. . ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
