从两个不同的大脑neuropiles或两个不同的解剖大片外同时长期记录成立于蜜蜂。这些录音允许神经元处理跨在单个神经元以及在一个动物行为的合唱水平不同脑区时间方面的调查。
在哺乳动物和昆虫的神经元信息在不同的高,低阶大脑中枢处理。这些中心通过收敛和发散的解剖连接,包括前馈和反馈线路耦合。此外,同一来源的信息,部分通过并行的途径不同,有时在同一个脑区发送。理解的进化优势这些布线策略,尤其是它们在彼此的时间相依性以及计算的优势,有必要同时访问单一的神经元在相同的制备在高时间分辨率的不同束或neuropiles的。在这里,我们专注于蜜蜂通过展示一种独特的细胞外长期访问在随后的两个neuropiles 1,触角叶(AL),第一嗅觉处理阶段和蘑菇体(MB),高阶整合中心INVO记录多单位活动LVED在学习和记忆的形成,或两个平行的神经传导通路2连接AL与MB。后者被选为为例,在充分进行说明。在支持视频的建设和灵活的多通道电极丝永久插入被证实。的微电极丝通道的成对差动放大大大降低了噪音并验证该信号的来源密切相关,在电极前端的位置。所使用的线电极的机械灵活性允许稳定侵袭性的长期记录在许多小时到几天,这是一个明显的优点相比,传统的额外的和细胞内体内记录技术。
蜜蜂以及大多数其他昆虫倚重嗅觉。其中包括他们用嗅觉线索进行定向,交配,与同类沟通,和觅食。他们也阐述了嗅觉系统有助于与花香气味刺激的学习行为的丰富剧目。这些行为可以在受控的实验室条件下很容易地研究(综述见3 – 5)。他们的“小脑筋”(CP. 6)与他们的数量相对较少的神经元,使蜜蜂一个非常适合的模式生物研究嗅觉编码和监控神经活动的过程中学习。
嗅觉系统在昆虫以及哺乳动物中示出类似的组织,极大程度(有关综述见7,8)。在蜜蜂约80,000受体神经元9坐落在sensillae沿着天线10,11翻译环境的刺激气味进入neurONAL信号。从嗅觉受体神经元轴突支配触角叶(AL),其中有一个肾小球组织媲美脊椎动物嗅球。美联包括约164肾小球了约000名当地的interneurons(LN)的相互连接(综述见12)。特别是在蜜蜂它最近已表明,淋巴结提供片状横向连接及不同亚群具有元素和configural嗅觉编码属性13,14。对AL被证明是细分为腹侧和背侧半叶的内侧和外侧触角叶道(米-和l-ALT引起;以前称为米-和l-APT对于内侧 – 外侧和触角叶protocerebral道15 – 17)。在这里,通过最近的努力,对昆虫大脑的统一命名法引入了一个新的道术语将被使用18。既低价竞标(1 – 和m-ALT)结合或410(1-ALT)或510(M-ALT)uniglomerular PROJECTION神经元(PN),分别为15,16,19。两个大片的PN最近被证明在并行代码2气味(综述见17,20),两者大片形成突触连接的分歧与肯扬细胞(KC)的蘑菇体(MB)的主要神经元。每个MB包含172,000枯否21 – 23。该宏块是已知的能参与刺激整合,学习和记忆形成。角质形成的轴突树突形成蒂(蘑菇的茎),这主要有两个输出区域:Vertica的或α-叶和水平或β-叶22,24。该MB的输出收敛到只有约400外在的神经元(EN)24。 ENS负责嗅觉信息处理大多是受神经支配的垂直波瓣22的腹侧。最近,已经显示,记录在此区域登记护士进行编码的气味奖励关联25。
时间为昆虫和脊椎动物的嗅觉系统内有何看法已经成为一个潜在的编码原则26的一个重要和显著的方面– 29。为了能够从不同的站点在高时间分辨率的同时记录多个神经元,建立了利用介绍给不同的目标区域在蜜蜂的嗅觉系统定制的多通道电极丝双多单元记录技术。这种方法使我们在单个神经元和神经元之间要么平行嗅觉通路,双嗅觉通路2或不同的后续neuropils 1之间的人口水平,分析和比较的时间处理在蜜蜂的嗅觉系统。最近使用的电极不同的配置类似的实验方法在蝗虫嗅觉系统30能够分析时空编码机制的背景不变的气味识别31。钍我们所建立的双重录音启用收集有关神经元的同步活动的空间分布信息。
相比,从钙成像获得更广泛的空间抽样此方法允许记录从只有两个斑点。然而,其优点相比,钙成像技术是动作电位的记录,这是不能由任何常规的CCD成像或2光子成像采集提供了高的时间精度。这里所描述的外电极被永久植入和相对固定的脑和头壳避免电极漂移。这是一个明显的优势相比,锐细胞内电极的使用。相比,细胞内的录音和钙成像另一个优点是延长神经观察时间从几个小时到几天。这是考察学习和记忆的形成神经相关的重要前提。多额外的好处单元录音在讨论部分进一步概括。
在这种方法概述定制设计电极丝的生产过程将显示,改编自32,33和适合长期多单元记录在蜜蜂的大脑进行。此外,一个实施例如何将这些类型的电极被永久地植入在蜜蜂嗅觉系统内的两个不同位点的记录同时记录第l和第m-ALT以上的时间,以允许许多刺激方案长时间显示2。为了验证该记录位置的记录点的染色和后期录音可视化的例子和协议提供。
本文演示了生产和定制设计的多通道微线电极的使用。所描述的电极适用于记录单单元和人口活动,是为一个单一的样本内延迟测量和不同的神经元和不同neuropils其他时间响应特性尤其有用(详见1,2,25)。此外,我们还展示了如何实现永久微电极导线允许在行为的持续时间可达几天蜜蜂稳定的长期记录。
胞外多单元录音成为一个有利的工具来实现结合空间信息的高时间分辨率。在我们的例子中,这些要么是平行的神经传导通路2或两个不同的neuropils 1。多个神经元可以被记录和分析以并联的单神经元水平和高时间分辨率。多单元记录英格斯首次在哺乳动物38应用,后来又在昆虫39 – 41。与胞外多通道记录技术42,43的发展和改善,取得了实质性进展。这一点,例如,包括新的电极44或新颖的秒杀分类和聚类算法45的发展。胞外多单位记录技术的一般方法有很好的描述46 – 48。在这个视频中显示的自建电极还可以通过增加每个电极更微丝或微线可以被扭曲,以获得尖端之间的可测量的距离不断进行调整。这两个程序会然而,导致降低柔韧性和增加电极的厚度。
相较于矽探针常用于细胞外记录在像鹰蛾,蝗虫和蟑螂40,49大得多的昆虫– </SUP> 51所描述的微线电极是小的,灵活的,可以与潜在的脑运动轻松应对,因此,能够可靠地在像蜜蜂和蚂蚁小的社会性昆虫,显示更广泛的行为库使用。大多数硅胶探头有柄锋利状结构切割轴突和神经组织沿其插入通道,而所述微线是圆的,灵活的和更小的,并因此危害较小周围组织这是一个明显的优势,如果我们的目标是研究长长期的可塑性在一个完整的和行为的动物。微电极丝的另一个优点是其低成本的生产和容易处理。而不是仔细清洗昂贵的有机硅探头的电极布线前脑插入新鲜切割的,因此,缺乏拥塞问题的。此外,有可能使用一个以上的微电极丝在同一制剂中不同neuropiles 1°或插入ř大片2,因为我们在这里展示。这种方法特别有利于分析和比较的时间方面,如响应延迟和相互作用在不同的神经处理水平。
我们都知道一个事实,即细胞外记录的信号并不能反映单个细胞的活动本身 。它始终是活动的电压的电极头周围的化合物。精确定位的一个电极内的两个相邻的微线信道的差总是计算出的信号源。因此,源用来提取单单位活动的尖峰信号总是非常接近一个或导致容易分辨的尖峰波形,另一个电极通道。从更远的信号,像邻近neuropils的肌肉活性或活性,达到两个电极同时唤起可比的形状和振幅,并将由该过程被丢弃。使用的Spike2的模板匹配手法,我们非常有信心获得一个单位的活动,这是不一样的,但非常接近单个神经元的活动。然而,就可以避免秒杀排序的问题用细胞内记录技术。
单细胞记录与任何锋利的电极或补丁移液器允许对单个神经元的生理特性深入了解。然而,由于昆虫神经元的体积小,它们的轴突( 如 。,小于1微米的蜜蜂的PN 52)只有短期的录音是可以管理的。此外,细胞内记录可能是侵入性的,并可能损害其可能是另一个原因,时间限制的细 胞, 在体内细胞内记录的昆虫很少拖垮一个小时。一时间窗口,它足以让马丁锤53的开创性工作谁从单一识别神经元,腹未成maxilar神经元#1(VUMmx1)记录细胞内。他可以升墨其活性直接奖励的途径。朱莉安Mauelshagen 54细胞内登记的识别蘑菇体外在神经元的活动中,pedunculus外在神经元#1(PE1)经典条件反射中。同样的神经元在门泽尔和曼茨55的焦点,当他们发现LTP凯尼恩细胞的电刺激后。不过,冈田和他的同事56可以使用在细胞内很好的特点扣球模式(双人间和三人间穗)为PE1的过程中细胞外记录的标识。后两种方法的所有组合,从确定神经元和细胞外长期录制细胞内的录音可能是一个强大的工具,为今后的调查。
但是,使用锋利的电极在不同的加工水平在许多小时到几天同时记录多个单元格(单元)来分析他们的时间响应关系和/或连塑改变我几乎是不可能的。
与第一钙成像方法在蜜蜂57,58使用钙敏感染料气味的反应空间格局的分析是访问的59 – 62。然而,在许多情况下,钙敏感染料具有被引入到通过侵入性的操作是再次限制了蜂的寿命,并且所分析的细胞的内在特性的脑组织。这一问题已被克服其他模式生物如使用基因引入钙传感器63,64的果蝇。然而,在一般情况下,钙的传感器可以引入其他的限制,因为它们可以作为钙缓冲,有可能影响到气味反应的时间特征。同时细胞内记录与钙结合影像学或计算方法可以证明成像的适当时间分辨率处理65,66。然而,在成像过程本身的时间分辨率是过早地ř有限。光学采集系统通常使用的CCD成像的5-20赫兹67时间分辨率,虽然2 -光子成像也许能获得更快的序列68。但是,增加采样率总是伴随着空间分辨率的损失。此外在蜜蜂中使用的钙敏感染料经受漂白,这也降低了捕获时间69。
相比于其他昆虫生理记录技术,我们的灵活的多通道微电极丝来确保单个单元和行为蜜蜂群体神经元活动的长期访问。
我们演示了如何使用其中的两个电极在不同加工阶段中相同的动物,这有利于不同记录点之间的时间编码方面的分析。依赖于研究问题和模型昆虫电极的建筑在这里证明的基本方法很容易扩展能和/或可以适应。例如可以设想使用超过三个单丝,以产生多通道电极。此外,记录点的个数可以被扩展和观察的两个以上的大片或neuropils时间方面是可行的。我们的希望是,这种方法会激发许多科学家和肯定,对复杂的神经元在处理小脑筋的理解作出贡献。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |