Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.
In entrambi i mammiferi e insetti informazioni neuronale viene elaborata in diversi centri cerebrali di ordine superiore e inferiore. Questi centri sono accoppiati tramite convergenti e divergenti connessioni anatomiche tra cui avanzamento e il cablaggio feedback. Inoltre, informazioni della stessa origine è parzialmente inviato attraverso vie parallele differenti e talvolta nelle stesse aree cerebrali. Per comprendere i vantaggi evolutivi, nonché i vantaggi computazionali di queste strategie di cablaggio e soprattutto i loro dipendenze temporali di ciascun altro, è necessario avere accesso simultaneo a singoli neuroni di differenti tratti o neuropiles nella stessa preparazione ad alta risoluzione temporale. Qui ci concentriamo sulle api dimostrando un unico accesso extracellulare lungo termine per registrare l'attività a più unità in due successive neuropiles 1, il lobo antennale (AL), la prima fase di elaborazione olfattiva e il corpo del fungo (MB), un ordine superiore centro di integrazione involved nell'apprendimento e nella formazione della memoria, o due tratti neuronali parallele 2 collegano il AL con la MB. Quest'ultimo è stato scelto come esempio e verrà descritta in dettaglio. Nel video di supporto è dimostrata la costruzione e l'inserimento permanente di elettrodi a filo multicanale flessibili. Amplificazione differenziale a coppie dei microcanali filo elettrodo riduce drasticamente il rumore e verifica che la sorgente del segnale è strettamente correlata alla posizione della punta dell'elettrodo. La flessibilità meccanica degli elettrodi a filo utilizzati permette registrazioni a lungo termine invasive stabili per molte ore fino a giorni, che è un chiaro vantaggio rispetto alle tradizionali tecniche di registrazione in più e intracellulari in vivo.
Le api così come la maggior parte degli altri insetti pesantemente affidamento su olfatto. Tra gli altri usano stimoli olfattivi per l'orientamento, l'accoppiamento, la comunicazione con i conspecifici, e foraggiamento. Il loro sistema olfattivo ben elaborato contribuisce ad un ricco repertorio di comportamenti di apprendimento relativi agli stimoli odori floreali. Questi comportamenti possono essere facilmente studiati in condizioni controllate di laboratorio (per la recensione vedi 3-5). I loro "mini-cervelli" (cfr. 6) con il loro numero relativamente piccolo di neuroni fanno le api di un organismo modello adatto per studiare la codifica olfattiva e di apprendimento durante il monitoraggio dell'attività neurale.
Il sistema olfattivo negli insetti e nei mammiferi mostra organizzazione analogo in gran parte (per una rassegna vedi 7,8). In api circa 80.000 neuroni recettori 9 situati in sensillae lungo le antenne 10,11 tradurre lo stimolo odore ambientale in un neursegnale onal. Assoni dai neuroni recettori olfattivi innervano il lobo antennale (AL), che ha un'organizzazione glomerulare paragonabile al bulbo olfattivo vertebrato. La AL comprende circa 164 glomeruli interconnessi tra loro da circa 4.000 interneuroni locali (LN) (per una rassegna vedi 12). Soprattutto nel ape è stato dimostrato recentemente che LNs forniscono connettività laterale irregolare e che le diverse sottopopolazioni possiedono elementari e configural olfattive proprietà di codifica 13,14. L'AL ha dimostrato di essere suddiviso in un lobo ventrale e dorsale hemi dando origine al mediale e il tratto lobo antenne laterali (-M e L-ALT; precedentemente definito-M e L-APT-mediale e laterale Lobe antenne protocerebral Tract 15 – 17). Qui un nuovo tratto terminologia introdotta da una recente sforzo per una nomenclatura unificata del cervello dell'insetto verrà utilizzato 18. Entrambi ALTs (l-e m-ALT) combinano sia 410 (l-ALT) o 510 (m-ALT) proge uniglomerularneuroni ction (PN), rispettivamente 15,16,19. PN di entrambi i tratti sono stati recentemente dimostrato che gli odori di codice in parallelo 2 (per la recensione vedi 17,20), ed entrambi i tratti sinapticamente formare connessioni divergenti con celle Kenyon (KC), il corpo di funghi (MB) neuroni principali. Ogni MB contiene circa 172.000 KC 21-23. MBS sono noti per essere coinvolti nella integrazione stimolo, l'apprendimento e la formazione della memoria. I dendriti AXO del KC formano il peduncolo (gambo del fungo), che ha due regioni di uscita principali: il vertica o alfa-lobo e orizzontale o beta-lobo 22,24. L'uscita del MB converge a solo circa 400 neuroni estrinseci (EN) 24. ENS responsabile per l'elaborazione delle informazioni olfattive soprattutto innervano l'aspetto ventrale del lobo verticale 22. Recentemente, è stato dimostrato che ENs registrati in questa zona codificano l'associazione odore premio 25.
Temporaleaspetti all'interno del sistema olfattivo di insetti e vertebrati sono diventati un aspetto importante e significativo come potenziale principio codifica 26-29. Per essere in grado di registrare simultaneamente più neuroni da diversi siti ad alta risoluzione temporale, abbiamo stabilito matrimoniali tecniche multiple di registrazione dell'unità utilizzo di elettrodi su misura a filo multicanale introdotte diverse regioni bersaglio nel sistema olfattivo delle api. Questo approccio ci permette di analizzare e confrontare l'elaborazione temporale nel sistema olfattivo delle api a livello dei singoli neuroni e delle popolazioni di neuroni o tra le vie olfattive parallele, il duplice percorso olfattivo 2 o tra i diversi neuropils successivi 1. Recentemente con un approccio sperimentale simile nel sistema olfattivo locusta 30 con una diversa configurazione degli elettrodi sono stati in grado di analizzare il meccanismo di codifica spazio-temporale per sfondo-invariante riconoscimento odore 31. Thnoi, i doppi registrazioni stabiliti consentono la raccolta di informazioni spaziali sulle simultanei profili di attività neuronali.
Rispetto al campionamento spaziale più ampio ottenuto da immagini di calcio questo metodo permette di registrare da soli due punti. Tuttavia, il vantaggio rispetto alle tecniche di imaging calcio è l'elevata precisione temporale di potenziali registrazioni d'azione, che non possono essere forniti da una CCD convenzionale o acquisizione di immagini 2-fotone. Gli elettrodi extracellulari qui descritti vengono impiantati in modo permanente e fissi rispetto al cervello e testa capsula evitando elettrodo deriva. Questo è un chiaro vantaggio rispetto all'utilizzo di elettrodi intracellulari taglienti. Un altro vantaggio rispetto alle registrazioni intracellulari e immagini di calcio è il tempo di osservazione neurale estesa vanno da molte ore fino a giorni. Questo è un presupposto importante per indagare i correlati neurali di formazione di apprendimento e memoria. Ulteriori vantaggi di piùregistrazioni unità sono ulteriormente descritti nella sezione di discussione.
In questa visione metodologica verrà mostrato il processo di fabbricazione di elettrodi a filo design personalizzato, adattato da 32,33 e adatto per lungo termine le registrazioni multi-unità nel cervello delle api. Inoltre, un esempio di come questi tipi di elettrodi sono impiantati in modo permanente in due differenti siti di registrazione all'interno del sistema olfattivo api per registrare simultaneamente è indicata la-l e m-ALT per lunghi periodi di tempo per consentire a molti protocolli di stimolazione 2. Per la verifica delle posizioni di registrazione è fornito un esempio e un protocollo per la colorazione e post visualizzazione dei siti di registrazione.
Questo articolo illustra la produzione e l'utilizzo di multi micro canale filo-elettrodi progettati su misura. Gli elettrodi descritti sono adatti per la registrazione sia per singola unità e l'attività della popolazione che è particolarmente utile per le misurazioni di latenza e altre proprietà di risposta temporale di diversi neuroni e diverse neuropils all'interno di un unico esemplare (per i dettagli vedi 1,2,25). Inoltre, abbiamo mostrato come implementare in modo permanente gli elettrodi a filo micro per consentire registrazioni stabili a lungo termine comportarsi api che durano per ore fino a giorni.
Extracellulari registrazioni multi-unit è diventato uno strumento favorevole per raggiungere alta risoluzione temporale combinata con informazioni spaziali. Nel nostro caso, questi sono o tratti neuronali in parallelo 2 o due differenti neuropils 1. Diverse neuroni possono essere registrati e analizzati a livello neuronale singola parallelamente e ad alta risoluzione temporale. Multi-unit registrazioneIngs sono stati applicati prima nei mammiferi 38 e successivamente anche negli insetti 39-41. Notevoli progressi è stato raggiunto con lo sviluppo e il miglioramento delle extracellulari tecniche di registrazione multicanale 42,43. Questo, per esempio, comprende lo sviluppo di nuovi elettrodi 44 o nuove picco di ordinamento e di clustering algoritmi 45. Metodi generali di tecniche di registrazione multi-unit extracellulari sono ben descritti 46-48. Gli elettrodi auto costruita mostrati in questo video inoltre possono essere adattati aggiungendo più microfili per elettrodo o micro fili possono essere intrecciati per ottenere misurabili distanze costanti tra le punte. Entrambe le procedure sarebbero, tuttavia, portare a diminuire la flessibilità e aumento dello spessore dell'elettrodo.
Rispetto alle sonde di silicio comunemente utilizzati per le registrazioni extracellulari in insetti molto più grandi, come il falco falena, locuste e scarafaggi 40,49 – </sup> 51 micro filo-elettrodi descritte sono più piccoli, flessibili e in grado di affrontare facilmente con i potenziali movimenti del cervello e, quindi, possono essere utilizzate in modo affidabile in piccoli insetti sociali come le api e le formiche che mostrano un repertorio comportamentale molto più ampio. La maggior parte delle sonde silicone hanno gambo appuntito come strutture di taglio assoni e tessuto neurale lungo il canale d'inserimento, mentre le micro fili descritti sono rotondi, flessibile e più piccole e sono quindi meno dannosi per il tessuto circostante che è un chiaro vantaggio se l'obiettivo è quello di studiare lungo plasticità termine in un animale intatto e di comportarsi. Un altro vantaggio di elettrodi a filo micro è la produzione a basso costo e la maneggevolezza. Invece di pulire accuratamente una sonda silicone costosi i fili elettrodi sono appena tagliato prima dell'inserimento cervello e, quindi, problemi mancanza di congestione. Inoltre è possibile utilizzare più di un filo elettrodo micro nella stessa preparazione sia inserita in diversi neuropiles 1 otratti r 2 come ci mostrano qui. Questo approccio è particolarmente favorevole per analizzare e confrontare aspetti temporali come latenze di risposta e interazioni a diversi livelli di elaborazione neurale.
Siamo consapevoli del fatto che un segnale registrato extracellulare non riflette l'attività della cellula singola per sé. E 'sempre un composto di attività tensione attorno alla punta dell'elettrodo. Per individuare la sorgente del segnale differenza dei due canali fili micro limitrofi entro un elettrodo viene sempre calcolata. Così la sorgente per i segnali spike utilizzati per estrarre l'attività singola unità era sempre molto vicino a uno o l'altro canale elettrodo conseguente forme d'onda spike facilmente distinguibili. I segnali provenienti da più lontano, come attività muscolare o attività di neuropils limitrofi, raggiungono entrambi gli elettrodi allo stesso tempo evocando forme e ampiezze comparabili e vengono scartati da questa procedura. Utilizzando la tecnica del modello corrispondente di Spike2,siamo molto fiduciosi di ottenere l'attività singola unità, che non è lo stesso, ma molto vicino all'attività singolo neurone. Tuttavia, la questione del picco ordinamento potrebbe essere evitato utilizzando tecniche di registrazione intracellulare.
Registrazioni cella singola sia con elettrodi taglienti o pipette di patch consentono conoscenza approfondita sulle proprietà fisiologiche di un singolo neurone. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dei neuroni degli insetti e delle loro neuriti (ad es., Meno di 1 micron per le api PN 52) le registrazioni solo a breve termine sono gestibili. Inoltre, le registrazioni intra cellulari potrebbero essere invasivi e potrebbero danneggiare la cellula che è forse un altro motivo per i limiti temporali. Nel vivo registrazioni intracellulari negli insetti raramente sopravvivono un'ora. Una finestra di tempo che è stato sufficiente per il lavoro pionieristico di Martin Hammer 53, che ha registrato intracellulare da un singolo neurone identificato, il ventrale spaiato maxilar neurone # 1 (VUMmx1). Poteva linchiostro sua attività direttamente al percorso premio. Juliane Mauelshagen 54 registrato intracellulare l'attività di un fungo identificato corpo estrinseca neurone, il peduncolo neurone estrinseca # 1 (PE1) durante il condizionamento classico. Lo stesso neurone era nel fuoco di Menzel e Manz 55 quando hanno trovato LTP dopo la stimolazione elettrica delle cellule Kenyon. Tuttavia, Okada e colleghi 56 potrebbero usare l'innalzamento della intracellulare ben caratterizzato (punte doppie e triple) per l'identificazione del PE1 durante le registrazioni extracellulari. Dopo tutto una combinazione di entrambi i metodi, registrazioni intracellulari da neuroni identificati e registrazioni extracellulari lungo termine potrebbero essere un potente strumento per le indagini future.
Tuttavia, utilizzando elettrodi appuntiti per registrare più cellule (unità) simultaneamente a diversi livelli di elaborazione oltre molte ore fino a giorni per analizzare le loro relazioni risposta temporali e / o anche i cambiamenti plasticis quasi impossibile.
Con la prima rappresentazione di calcio si avvicina nel ape 57,58 con coloranti calcio-sensibile l'analisi dei modelli spaziali di risposte odori erano accessibili 59-62. Tuttavia, in molti casi i coloranti sensibili calcio devono essere introdotti al tessuto cerebrale tramite manipolazioni invasive che limitano nuovamente vita delle api e le proprietà intrinseche delle cellule analizzate. Questo problema è stato superato in altri organismi modello come il moscerino della frutta utilizzando sensori di calcio geneticamente introdotte 63,64. Tuttavia, in generale, i sensori di calcio possono introdurre altre limitazioni in quanto possono agire come buffer di calcio che possono influenzare le proprietà temporali dei cattivi odori. Registrazioni intracellulari simultanee combinate con immagini di calcio o approcci computazionali in grado di dimostrare la risoluzione temporale corretta delle immagini processi 65,66. Tuttavia, la risoluzione temporale del processo di imaging in sé è piuttosto cr limitato. Sistemi di acquisizione ottica di solito usano CCD-imaging con una risoluzione temporale di 5-20 Hz 67, anche se 2-Photon-imaging potrebbe essere in grado di acquisire sequenze veloci 68. Tuttavia, aumentando la frequenza di campionamento va sempre con una perdita in risoluzione spaziale. Inoltre i coloranti calcio-sensibile utilizzato nelle api subiscono sbianca, che riduce anche il tempo di acquisizione 69.
Rispetto ad altre tecniche di registrazione fisiologiche negli insetti nostri elettrodi micro-filo multicanale flessibili garantiscono l'accesso a lungo tempo per singola unità e la popolazione l'attività neuronale nel comportarsi api.
Abbiamo dimostrato come utilizzare due di questi elettrodi in diverse fasi di lavorazione nello stesso animale, che facilita l'analisi degli aspetti codifica temporali tra i vari siti di registrazione. A seconda del problema di ricerca e il modello di insetti il metodo di base della costruzione dell'elettrodo dimostrato qui è facilmente estenderegrado e / o possono essere adattati. Ad esempio è concepibile utilizzare più di tre fili singoli per produrre elettrodi multicanale. Inoltre, il numero di siti di registrazione può essere estesa e osservando aspetti temporali più di due tratti o neuropils è fattibile. La nostra speranza è che questo metodo ispirerà molti scienziati e contribuirà positivamente alla comprensione di sofisticata elaborazione neuronale in piccoli cervelli.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Isabelle Reus for establishment of tracing the electrode insertion side, Tobias Rosenbaum for LabView programming, Anneke Meyer for data analyzes and helpful discussions. We thank Randolf Menzel for discussion and practical help during early stage of electrode development. Furthermore we thank Brian Smith for postdoctoral association to MS-B. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) to WR.
Paraffin oil | Fluka | 76235 | |
Odors | Sigma Aldrich | ||
PBS | pH 7.2 | ||
4% Formaldehyde | ThermoScientific | 28908 | Methanol free |
Triton X | BioChemica | A1388 | |
Methylsalicylate | Roth | 4529.1 | |
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby) | Invitrogen | D7162 | keep dark |
Alexa 488 hydrazide | Invitrogen | A-10436 | keep dark |
Alexa 568 hydrazide | Invitrogen | A-10437 | keep dark |
Bee Ringer Solution | see 2 | ||
Polyurethane-coated copper wire | Elektrisola | 15µm diameter & P155 insulation | |
Dental Wax | Densply Detrey | 64103015S1 | moderate melting point |
Dental Wax | Flexaponal | 124-202-00 | low-melting Wax |
KWIK SIl | WPI | 03L | |
18 Pin Socket | Conrad Electronic | 189634-62 | |
Hot melting glue | Conrad Electronic | 827673 | |
soldering needle | Conrad Electronics | 830283 | 12 V |
Soldering terminal lug | Conrad Electronic | 531901 | |
Glaselectrodes | WPI | 1B100F-3 | |
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | V2A 0.2 x 12 mm |
switchable headstage | Tucer Davis Technologies | SH16 | |
Headstage connection module | NPI | INT-03M | |
Amplifier Module | NPI | PDA-2F | |
Data Acquisition boards | National Instruments | NI-6123, Ni-6143 | |
Acquisition Software | National Instruments | Lab View 8.2 | custom design |
Spike-Sorting | CED | Spike 2 v7.11 | |
Matlab | Mathworks | R2008B | |
Micromanipulator | Leitz | manual | |
AG-wires | WPI | AGT05100 | |
Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP2 AOBS | |
AMIRA | Mercury Computer Systems | 2/5/2000 |