Måling respiratoriske funktion på mus med Hæmningsløs Helkrops plethysmografi
Summary
Vurderingen af respirationsfysiologi har traditionelt påberåbes teknikker, der kræver fiksering eller sedering af dyret. Uhæmmet hele kroppen plethysmografi giver imidlertid præcis, ikke-invasiv, kvantitativ analyse af respirationsfysiologi i dyremodeller. Desuden giver den teknik gentagne respiratoriske vurdering af mus giver mulighed for longitudinelle studier.
Abstract
Respiratorisk dysfunktion er en af de førende årsager til sygelighed og dødelighed i verden og de dødelighed fortsætter med at stige. Kvantitativ vurdering af lungefunktionen i gnavermodeller er et vigtigt redskab i udviklingen af fremtidens behandlingsformer. Almindeligt anvendte metoder til vurdering af respiratorisk funktion, herunder invasiv plethysmografi og tvungen svingning. Mens disse teknikker give værdifulde oplysninger, kan dataindsamlingen være fyldt med artefakter og eksperimenterende variabilitet på grund af behovet for anæstesi og / eller invasiv instrumentering af dyret. I modsætning hertil uhæmmet hele kroppen plethysmografi (UWBP) tilbyder en præcis, non-invasiv, kvantitativ måde ved at analysere respiratoriske parametre. Denne teknik undgår anvendelsen af anæstesi og begrænsninger, der er fælles for de traditionelle plethysmografi teknikker. Denne video vil demonstrere UWBP proceduren herunder udstyr sat op, kalibrering og lungefunktion optagelse. Detvil forklare, hvordan at analysere de indsamlede data, samt identificere eksperimentelle outliers og artefakter, der skyldes flytning af dyr. De respiratoriske parametre opnået ved hjælp af denne teknik omfatter tidalvolumen, minutvolumen, inspiratorisk arbejdscyklus, inspiratorisk flow og forholdet mellem inspiration tid til udløbet tid. UWBP ikke stole på specialiserede kompetencer og er billige at udføre. Et centralt element i UWBP og mest tiltalende for potentielle brugere, er evnen til at udføre gentagne målinger af lungefunktion på det samme dyr.
Introduction
Lunge dysfunktion er en af de førende årsager til sygelighed og dødelighed i verden. Tilstanden er karakteriseret ved utilstrækkelig ilt udveksling, synonymt med hoste, brystsmerter og dyspnø. Respiratorisk sygdom tegner sig for ~ 10% af dødeligheden på verdensplan 1. Ifølge World Health Organization, er dødeligheden vil stige på grund af vedvarende rygning, forurening og erhvervsbetingede irritanter. UWBP er en nyttig tilføjelse til undersøgelse lunge fysiologi, som kraftigt komplimenter traditionel biokemiske og histologiske analyser 2. Andre procedurer, der anvendes til lunge vurdering ikke giver de samme fordele som UWBP. Invasiv plethysmografi er en almindeligt anvendt teknik, der kræver, at dyr, der skal bedøvet 3,4 og dermed ikke nødvendigvis afspejler en naturlig tilstand som følge respiratoriske målinger. Endvidere er kravet om mekanisk ventilation og kemiske udfordringer udelukker fremtidige målinger 3,4.En anden metode til at indsamle respiratorisk data ved tvungen oscillation, som er mere følsom til finere ændringer i respiratoriske parametre i forhold til UWBP 5. Tvungen svingning er imidlertid en invasiv teknik og kræver dyr opsigelse til dataindsamling 5-7.
UWBP indebærer at placere et dyr inde i en specialiseret afdeling. Under inspiration, er tidevandsenergi luft varmes og fugtes i lungerne vanddamptryk stigende og forårsager termisk ekspansion af gas 8. Denne virkning medfører en nettoændring luftmængde skabe en forøgelse i trykket i plethysmograf kammeret 8. Det modsatte sker under udånding skabe en respiratorisk bølgeform fra dyret. Waveform analyse anvendes derefter til at måle fra det respiratoriske spor: respirationsfrekvens (vejrtrækninger / min), total vejrtrækning cyklus tid (sek), inspiration / udløbstid (Ti / Te, sek) og ændringer i trykket på grund af hver tidalvolumen (P T). <strong> Figur 1 illustrerer hver målinger stammer fra en respiratorisk spor. Disse målinger er let at beregne, og flere respiratoriske parametre kan afledes fra disse målinger. Disse parametre omfatter: Tidalvolumen (mængden af luft bevæges mellem normal indånding og udånding), minutvolumen (mængde gas inhaleres fra lungerne per minut), inspiratorisk arbejdscyklus (procentdelen af inspiration tid til den samlede åndingscyklus varighed) og inspiratorisk strømningshastighed (mængden af luft inspireret i en given tid).
UWBP giver præcis, non-invasiv, kvantitativ analyse af respirationsfysiologi i dyremodeller og kan anvendes til måling af progression af luftvejssygdomme og lungefunktion 6,9. I modsætning til andre plethysmografi teknikker UWBP undgår brugen af anæstesi, begrænsninger og invasive manipulationer, der producerer artefakter og eksperimentel variabilitet 6,9. Anæstesi kan undertrykke respirationændre puls og kan være udfordrende at regulere 10. Begrænsninger fremkalde en stigning i respiration på grund af yderligere stress via corticosteron og adrenalin frigive 11,13. Det centrale element i UWBP gentages fysiologisk vurdering gør det muligt at foretage longitudinelle studier. UWBP kan stærkt anbefales til den langsgående vurdering af lunge fysiologi og tilbyder en værdifuld færdighed for fremtidig respiratorisk vurdering stof.
Bleomycin, ægalbumin, og hypoxi er blevet anvendt til at inducere respiratoriske udfordringer i flere studier og UWBP har med succes målt nøjagtig lunge fysiologiske vurdering 7,9,13-16. Den beskrevne protokol er designet til standard voksen laboratoriemus. Imidlertid har UWBP blevet tilpasset til andre dyr, såsom rotter, marsvin og primater 17-20. UWBP er ikke begrænset kun at vurdere lungedysfunktion men er også blevet brugt til vurdering af lunge modning 3.Alsidighed, enkelhed og reproducerbarhed UWBP har etableret en fremragende teknik til vurdering af pulmonal funktion i dyr. Forskellige software (se materialer og udstyr tabel) vil være forpligtet til at følge denne fremgangsmåde. En erfaren videnskabsmand ville være i stand til at udføre denne protokol med en mus inden for 1 time.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne teknik er en ikke-invasiv metode til vurdering af respiratoriske parametre for uhæmmet og unanesthetized mus. Styrkerne i denne protokol omfatter dens enkelhed og præcision til at måle lungefunktion på langs med minimal artefakter. Der er dog visse begrænsninger og kritiske trin bemærkes om proceduren. Først og vigtigst af alt, skal musen forblive rolig i kammeret i mindst fem sekunder. Tilføjet stress vil forstyrre vejrtrækning mønster af musen og dermed give variable resultater (fig…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | – | Mac OS X 10.4 or later |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5ml serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- . . World Health Organization, World Health Statistics. , (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
