Live-Imaging van<em> Drosophila</em> Larvale neuroblasts

Summary

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Abstract

Stamcellen verdelen asymmetrisch twee nakomelingen cellen met ongelijke lot potentieel te genereren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. Gezien hun relevantie voor ontwikkeling en ziekte, het begrijpen van de mechanismen die bepalen asymmetrische stamcellen divisie heeft een robuust gebied van studie geweest. Omdat ze genetisch handelbaar ondergaan opeenvolgende ronden van celdeling ongeveer eenmaal per uur, de stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel of neuroblasts, onmisbaar modellen voor de studie van stamcellen celdeling. Ongeveer 100 neurale stamcellen zijn gelegen nabij het oppervlak van elk van de twee lobben larvale hersenen, waardoor dit modelsysteem bijzonder bruikbaar voor levende beeldvorming microscopie studies. In dit werk, bespreken we verschillende benaderingen op grote schaal gebruikt om stamcellen divisies visualiseren, en we pakken de relatieve voor-en nadelen van de technieken die in dienst gedistantieerd versus intacte hersenen weefsels. We hebben ook detail onze simplifIED protocol dat wordt gebruikt om hele hersenen explanteren uit derde instar larven voor live cell imaging en vaste analyse toepassingen.

Introduction

Stamcellen handhaven van een balans tussen differentiatie en zelfvernieuwing om cellulaire diversiteit te genereren tijdens de vroege ontwikkeling en beschadigde cellen in volwassen weefsels. Regulering van deze homeostase voorkomt zowel verlies en over-expansie van de stamcelpopulatie, wat kan leiden tot schadelijke weefsel degeneratie of tumorvorming.

Neuroblasts (NBs) zijn uitgebreid bestudeerd neurale stamcellen van de Drosophila centrale zenuwstelsel (figuur 1A) die eerste vorm tijdens embryonale stadia ^{1, 2.} NBs ondergaan herhaalde rondes van asymmetrische celdeling (ACD) tot twee ongelijk gedoemd cellen produceren: een zelfvernieuwende stamcel en een differentiërende cel. ACD wordt geleid door centrosomes de niet-membraneuze organellen die fungeren als microtubuli-organiserende centra van de meeste cellen ^3. Tijdens de mitose, NB centrosomes organiseren en oriënteren de bipolaire mitotische spoel langs de apicale-basale polaireteit as. Na splitsing van het verdelen van NB, apicale lot determinanten die de stamcellen lot specificeren, en basale lot determinanten die differentiatie opgeeft, worden gescheiden in de ongelijke dochtercellen.

In het larvale centrale hersenen, kan twee soorten AI's worden onderscheiden door hun aantal, plaats, transcriptiefactor expressie en cellijn (Figuur 1A) ^4-6. Type I NBs zijn de meest voorkomende, en ongeveer 90 van hen bevolken de voorste en achterste zijden van elk optische kwab van de hersenen ^7. Deze AI's drukken de transcriptiefactor Asense (Ase), en ze karakteristiek verdelen in een zelfvernieuwende NB en een kleinere ganglion moeder cel (GMC; Figuur 1B). Elke GMC ondergaat een enkele terminal divisie twee neuronen of glia (Figuur 1B) te genereren. Daarentegen acht Type II NBs dat de achterste zijde van elke optische kwab stijging gebrek Ase expressie ^5. Ze ondergaan ACDeen zelfvernieuwende NB en een tussen neurale voorlopercellen (INP) produceren.

De INP beurt asymmetrisch drie tot vijf keer. Elk van deze afdelingen leidt regeneratie van de INP en de productie van een GMC ^4. Gezamenlijk specifieke NB identiteit en de temporele volgorde GMC baart tot de verbazingwekkende neuronale diversiteit van de volwassen centrale zenuwstelsel.

Inzicht in de celbiologie dat NB ACD ten grondslag ligt is sterk verbeterd door het gebruik van live-cell imaging technieken. Gepubliceerde protocollen gebruikt door onderzoekers op de foto voor live AI's lopen sterk uiteen. Kortom, maar deze werkwijzen kunnen worden ingedeeld in twee algemene categorieën onderscheiden door of de larvale hersenen intact wordt gelaten of mechanisch gedissocieerd. Beide technieken hebben verschillende voor-en nadelen, afhankelijk van de toepassing van de onderzoeker.

Vroege rapporten een onthullende live NB cel divilingen tot op zekere mate van handmatige dissociatie van de larvale hersenen. Deze protocollen detail vegen ⁸ of plagen elkaar ⁹ van de hersenen om op korte termijn primaire culturen van de AI's op dekglaasjes groeien. Om beeldvorming te verbeteren, zijn de ronde NBs meestal afgeplat op de dekglaasjes met ofwel glasplaatjes ⁸ of agarose pads ^9. Hoewel afgeplatte cellen optiek verbeterd, deze technieken leidt vaak tot NB mitotische afwijkingen, waaronder regressie van de splitsing groef en het onvermogen om meer dan een keer te verdelen. Daarom protocollen die zowel handmatig dissociatie en fysieke verstoring van de larvale hersenweefsel te betrekken zijn over het algemeen alleen geschikt voor zeer korte termijn (dat wil zeggen., Een celcyclus of minder) toepassingen. Ook semi-kneuzingen of volledig afvlakking intacte hersenen tussen glas dia's en dekglaasjes beperkt de tijd die men kan besteden beeldvorming van een bepaald monster aan een ongeveer 30 min. periode ^10. Ondanks deze beperking, thiDe aanpak is succesvol ^11-14 gebruikt.

Recente inspanningen om het leven los NBs limiet fysieke verstoring van de geïsoleerde cellen. Deze technieken zijn bijzonder nuttig voor toepassingen waarbij het nodig is celculturen ondersteunen voor meerdere celdeelcycli. Bijvoorbeeld kan gedispergeerde cellen van handmatig gescheiden hersenen gedeeltelijk ingebed in een stolsel gemaakt van het mengsel van fibrinogeen en thrombine ¹⁵ voor langdurige weergave ^16. Alternatief kan geëxplanteerde hersenen eerst chemisch gedissocieerd met het enzym collagenase, naast handmatig verstoord door herhaalde passage door een pipetpunt en vervolgens uitgeplaat op poly-L-lysine beklede glazen bodem schotels ^{17, 18} zijn. Coating glazen schalen met ofwel fibrinogeen of poly-L-lysine bevordert de hechting en geringe verspreiding van ronde cellen, waardoor ze zo dicht mogelijk bij het dekglaasje mogelijk zonder grote fysieke vervorming. In additiop, deze methodes is het kweken van de AI's in medium dat gemakkelijk kunnen worden ingewisseld voor farmacologische verstoring experimenten ^18. Over het algemeen, direct plating verspreid NBs verbetert beeldvorming optiek zonder in te boeten op lange termijn imaging-mogelijkheden. Onlangs heeft een protocol waarin de langdurige kweken van gedissocieerde NBs zijn uitgewerkt ^19.

Deze benadering is niet zonder beperkingen. Er zijn verschillende kanttekeningen om live los NBs beeldvorming. Op een gebied van gedispergeerde cellen, bijvoorbeeld, is het moeilijk specifieke NB lijnen die ruimtelijk georganiseerd in de intacte hersenen ¹ identificeren. Ook onderscheiden de Type I versus type II AI's binnen gedissocieerde weefsel is ook uitdagend, zonder de uitdrukking van lineage tracers of subtype-specifieke transgenen, zoals worniu-GAL4, asense-GAL80 ^20. Hoewel deze transgenen zijn zeer nuttig voor sommige toepassingen, ze onderzoekers beperken tot die transgenen afgedrukt onder de controle van de UAS enhancer element ²¹ en vereisen meer complexe genetische systemen. Studies die betrekking hebben op de ruimtelijke of temporele ontwikkeling AI's vergen dus in vivo in het kader van een intact weefsel.

Daarnaast hebben studies gedissocieerde embryonale NBs blijkt dat het fysieke contact van aangrenzende cellen is cruciaal voor de interfase lokalisatie van belangrijke determinanten polariteit ^{22, 23.} Deze studies tonen volledig geïsoleerd NBs de invariante mitotische spindel-as niet meer te handhaven. In plaats daarvan, deze cellen vertonen een gerandomiseerde spilas en brede hoeken scheiding tussen opeenvolgende GMC knoppen, misschien door het verlies van apicale centrosome positionering ^22. Hoewel de relatie tussen de larvale AI's en hun naburige cellen is niet uitgebreid zijn onderzocht, is het gezien het feit dat de larvale stamcel micro-omgeving kan van invloed zijn op cel polariteit of andere waardgedrag. Om de fysiologische context van larvale NBs te behouden, we afbeelding ACD van hele hersenen.

Gezien de inherente beperkingen in verband met beeldvorming gedissocieerde AI's, hebben ons lab en anderen protocollen opgesteld om de afbeelding opeenvolgende ronden van NB ACD uit hele larvale hersenen. Technieken om het intacte hersenen vaak vervangen de starre oppervlaktelaag van het glas aan een zijde van de kweekkamer met een flexibel membraan om weefsel verstoring of schade te voorkomen en zorgen voor gasuitwisseling. Sommige werkwijzen omvatten montage geëxplanteerd hersenen in een mengsel van insecten kweekmedium, serum en ascorbinezuur met het vet organen geïsoleerd uit tien larven ^24. De geïsoleerde vet lichamen worden toegevoegd omdat ze scheiden een mitogeen bekend aan NB celdeling ²⁵ stimuleren. Dit protocol blijft de integriteit van het weefsel gedurende 3 uur en is derhalve vatbaar voor langdurige weergave ^{24, 26-28.} Onlangs heeft een protocol waarin de lonG termijn beeldvorming van intacte larvale hersenen in aanwezigheid van ascorbinezuur, serum, en vet lichamen is uitgewerkt ^29. Belangrijk, omdat het weefsel niet blootgesteld of geïmmobiliseerd is deze benadering minder geschikt voor toepassingen waarbij kweekmedium wordt uitgewisseld (bijvoorbeeld drugstudies, immunodepletie enz.).

Ons laboratorium heeft de ganse berg voorbereiding van levende larvale hersenen voor de lange termijn imaging ^{30, 31} vereenvoudigd. Het belangrijkste voordeel van ons protocol over anderen is zijn eenvoud: onze waarnemingen wijzen noch serum, ascorbinezuur, insuline, noch vet lichamen zijn nodig additieven op de foto opeenvolgende ronden van NB ACD. Hoewel toevoegsels, zoals insuline, zijn nuttig voor het aanhoudende beeldvorming van stamcellen celdelingen ³² en collectieve celmigratie in Drosophila eierstokken ³³ zijn, lijken ze overbodig voor NB ACD te zijn, als onze beeldmedium bestaat uit een eenvoudig mengsel van standard insect celkweek medium aangevuld met antibiotica-antimycotische om besmetting te voorkomen. Door het gebruik van herbruikbare gas-permeabel of glazen bodem cultuur gerechten, hebben we in staat om een ​​aantal rondes van opeenvolgende NB ACD's ondersteunen geweest. Dezelfde geëxplanteerde monsters kunnen gemakkelijk worden gebruikt voor immunofluorescentie en andere procedures met vaste weefsel. In dit protocol gedetailleerde weergave van de ontleding van intacte larvale hersenen, evenals de bereiding van hersenen van zowel levende en vaste analyse.

Protocol

1. Voorbereiding van de Benodigde aan derde Instar Larvale Brains Explanteer Bereid je gereedschap nodig voor microdissection. Smeden twee ontleden gereedschap (een scalpel en een haak) door eerst een dissectie pin in elke pin houder. Beveilig de pennen stevig met de hand of met een tang (figuur 1C). Gebruik een paar oude tang om een ​​ontleden pin buigen tot een ongeveer 120 ° hoek. Doe dit onder een dissectie microscoop om ervoor te zorgen dat de bovenste helft van d…

Representative Results

Live-beeldvorming heeft een aantal mechanismen die NB ACD opgehelderd. Vóór beeldacquisitie, moet de optimale imaging omgevingsomstandigheden. Het is noodzakelijk om het frame opnamesnelheid afwegen tegen de duur van live cell imaging. Voor fijne cellulaire analyse, bijvoorbeeld, verhoogde tijdelijke en optische resolutie kan worden verlangd. Bij het ​​visualiseren van een enkele NB celcyclus (Figuur 4A), kan de snelheid waarmee beelden worden vastgelegd worden verhoogd zonder de invoering van pho…

Discussion

Live cell imaging is een waardevolle benadering gebruikt om de mechanismen die ACD van stamcellen, de differentiatie van cellijnen reguleren te bestuderen, en de morfogenese van complexe weefsels. Hoewel onderzoeksgroepen verleden zijn gebruikt verschillende technieken om te visualiseren NB ACD, kunnen deze benaderingen algemeen worden ingedeeld in twee categorieën die vooral verschillen met betrekking tot de vraag of het hersenweefsel intact wordt gelaten of gescheiden.

Imaging los NBs hee…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.