के रहते इमेजिंग<em> ड्रोसोफिला</em> लारवल neuroblasts

Summary

इस प्रोटोकॉल एक अक्षुण्ण लार्वा के मस्तिष्क के संदर्भ में लाइव सेल इमेजिंग का संचालन करने के लिए इस्तेमाल एक सुव्यवस्थित विधि विवरण. लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण लगातार पहले से अनदेखी कर रहे थे कि तंत्र को उजागर करने, असममित तंत्रिका स्टेम कोशिका विभाजन के अध्ययन के साथ ही अन्य तंत्रिकाजन्य और विकास की प्रक्रिया के लिए अमूल्य हैं.

Abstract

एक स्वयं renewing स्टेम सेल और एक फर्क सेल: स्टेम सेल असमान भाग्य क्षमता के साथ दो संतान कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए asymmetrically विभाजित करते हैं. असममित स्टेम कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए एक मजबूत क्षेत्र रहा है कि सरकार तंत्र को समझने, विकास और रोग के लिए उनकी प्रासंगिकता को देखते हुए. वे आनुवंशिक विनयशील हैं और के बारे में एक बार हर घंटे कोशिका विभाजन की लगातार राउंड से गुजरना क्योंकि, ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, या neuroblasts के स्टेम सेल, स्टेम कोशिका विभाजन के अध्ययन के लिए अपरिहार्य मॉडल हैं. के बारे में 100 तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रहते इमेजिंग माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए इस मॉडल प्रणाली विशेष रूप से उपयोगी है, जिससे दो लार्वा के मस्तिष्क पालियों में से प्रत्येक की सतह के पास स्थित हैं. इस काम में, हम व्यापक रूप से स्टेम कोशिका विभाजन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया कई तरीकों की समीक्षा करें, और हम रिश्तेदार फायदे और बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में अलग है कि रोजगार उन तकनीकों के नुकसान का पता. हम भी विस्तार से हमारे simplifIED प्रोटोकॉल लाइव सेल इमेजिंग के लिए तीसरे instar लार्वा और तय विश्लेषण अनुप्रयोगों से पूरे दिमाग explant के लिए इस्तेमाल किया.

Introduction

स्टेम कोशिकाओं प्रारंभिक विकास के दौरान सेलुलर विविधता पैदा करते हैं और वयस्क ऊतकों में क्षतिग्रस्त कोशिकाओं की जगह एक भेदभाव का संतुलन और आत्म नवीकरण बनाए रखें. इस homeostasis के विनियमन के झड़ने और हानिकारक ऊतक अध: पतन या tumorigenesis में परिणाम कर सकते हैं जो स्टेम सेल की आबादी का अधिक विस्तार, दोनों को रोकता है.

Neuroblasts (NBS) ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (चित्रा 1 ए) भ्रूण चरणों ^{1, 2} के दौरान कहा कि पहले फार्म की व्यापक रूप से अध्ययन तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं रहे हैं. एक स्वयं renewing स्टेम सेल और एक फर्क सेल: NBs दो असमान नसीब कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए असममित कोशिका विभाजन (एसीडी) के दोहराया दौर से गुजरना. एसीडी centrosomes, सबसे कोशिकाओं ³ के microtubule का आयोजन केन्द्रों के रूप में कार्य है कि गैर झिल्लीदार organelles द्वारा निर्देशित है. पिंजरे का बँटवारा दौरान, नायब centrosomes व्यवस्थित और शिखर बेसल ध्रुवीय साथ द्विध्रुवी mitotic धुरा पूरबीअल्पसंख्यक अक्ष. विभाजित नायब की दरार पर, स्टेम सेल भाग्य निर्दिष्ट है कि शिखर भाग्य निर्धारकों, और भेदभाव निर्दिष्ट है कि बेसल भाग्य निर्धारकों, असमान बेटी कोशिकाओं में अलग कर रहे हैं.

लार्वा केंद्रीय मस्तिष्क, NBS के दो प्रकार उनकी संख्या, स्थिति, प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति, और सेल वंश (चित्रा 1 ए) ^4-6 से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. मैं NBs सबसे प्रचुर मात्रा में हैं टाइप करें, और के बारे में 90 उनमें से मस्तिष्क ⁷ से प्रत्येक ऑप्टिक पालि के पूर्वकाल और कूल्हों पक्षों आबाद. ये NBs प्रतिलेखन कारक Asense (एएसई) व्यक्त, और वे विशेषता से एक स्वयं renewing नायब में विभाजित है और एक छोटे नाड़ीग्रन्थि मां सेल (जीएमसी, चित्रा 1 बी). प्रत्येक जीएमसी दो न्यूरॉन्स या glia (चित्रा 1 बी) उत्पन्न करने के लिए एक टर्मिनल डिवीजन आए. इसके विपरीत, प्रत्येक ऑप्टिक पालि के पीछे की ओर आबाद कि आठ प्रकार द्वितीय NBs Ase अभिव्यक्ति ⁵ की कमी है. वे एसीडी गुजरनाएक स्वयं renewing नायब और एक मध्यवर्ती तंत्रिका पूर्वज (INP) का उत्पादन.

INP, बारी में, asymmetrically तीन से पांच गुना बिताते हैं. INP के उत्थान और एक भी जीएमसी ⁴ के उत्पादन में इन डिवीजनों परिणामों के प्रत्येक. सामूहिक रूप से, विशिष्ट नायब पहचान और जीएमसी जन्म के अस्थायी आदेश वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की अद्भुत neuronal विविधता को जन्म देता है.

नायब एसीडी underlies कि कोशिका जीव विज्ञान बेहद जीना सेल इमेजिंग तकनीक के उपयोग के माध्यम से सुधार किया गया है समझना. छवि लाइव NBS के शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल प्रकाशित प्रोटोकॉल व्यापक रूप से बदलती हैं. कुल मिलाकर, हालांकि, इन तरीकों लार्वा के मस्तिष्क बरकरार रह या यंत्रवत् अलग है कि क्या द्वारा प्रतिष्ठित दो सामान्य श्रेणियों में बांटा जा सकता है. दोनों तकनीकों शोधकर्ता के आवेदन के आधार पर अलग फायदे और नुकसान है.

लाइव नायब सेल प्रखंड खुलासा प्रारंभिक रिपोर्टवजहें लार्वा के मस्तिष्क का मार्गदर्शन हदबंदी के कुछ डिग्री शामिल है. इन प्रोटोकॉल विस्तार ⁸ smearing या कांच coverslips पर NBs की अल्पकालिक प्राथमिक संस्कृतियों बढ़ने के क्रम में अलग ⁹ मस्तिष्क चिढ़ा. इमेजिंग में सुधार, दौर NBs आमतौर पर कांच स्लाइड ⁸ या agarose पैड ⁹ के साथ या तो coverslips पर चपटा कर रहे हैं. चपटा कोशिकाओं प्रकाशिकी में सुधार हुआ है हालांकि, इन तकनीकों अक्सर दरार कुंड की प्रतिगमन और अधिक से अधिक एक समय विभाजित करने में असमर्थता सहित, नायब mitotic दोषों को जन्म दे. इसलिए, पुस्तिका हदबंदी और लार्वा के मस्तिष्क के ऊतकों की शारीरिक विकृति दोनों शामिल प्रोटोकॉल है कि आम तौर पर बहुत ही कम अवधि (यानी., एक सेल चक्र या कम) अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल हैं. इसी तरह, अर्द्ध squashing या पूरी तरह से कांच स्लाइड और coverslips के बीच बरकरार दिमाग सपाट एक एक लगभग 30 मिनट की अवधि ¹⁰ के लिए दिए गए नमूना इमेजिंग खर्च कर सकते हैं समय सीमा. इस सीमा, थी बावजूददृष्टिकोण सफलतापूर्वक ^11-14 इस्तेमाल किया गया है.

छवि लाइव करने के लिए हाल के प्रयासों NBs सीमा अलग कक्षों की शारीरिक विकृति अलग. इन तकनीकों में यह कई कोशिका विभाजन चक्र के लिए सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, जहां अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं. उदाहरण के लिए, मैन्युअल रूप से अलग दिमाग से छितरी हुई कोशिकाओं को आंशिक रूप से लंबे समय तक इमेजिंग ¹⁶ के लिए फाइब्रिनोजेन और थ्रोम्बिन ¹⁵ के मिश्रण से बनाया गया एक थक्का में एम्बेड किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, explanted दिमाग रासायनिक एंजाइम अगले स्वयं एक pipet टिप के माध्यम से दोहराया पारित होने से बाधित collagenase,, और बाद में पाली एल lysine लेपित गिलास नीचे व्यंजन ^{17, 18} पर चढ़ाया साथ अलग पहले हो सकता है. फाइब्रिनोजेन या पाली एल lysine के साथ या तो कांच के बर्तन कोटिंग प्रमुख शारीरिक विकृति के बिना संभव के रूप में coverslip करने के लिए उन्हें करीब लाने, गोल कोशिकाओं के प्रसार लगाव और मामूली बढ़ावा देता है. Additi में, पर इन तरीकों आसानी से औषधीय गड़बड़ी प्रयोगों ¹⁸ के लिए विमर्श किया जा सकता है कि मध्यम में NBs संवर्धन शामिल है. कुल मिलाकर, सीधे चढ़ाना NBs लंबी अवधि इमेजिंग क्षमताओं का त्याग किए बिना इमेजिंग प्रकाशिकी को बेहतर बनाता है छितरी हुई है. हाल ही में, अलग NBs की लंबी अवधि के संवर्धन का वर्णन एक प्रोटोकॉल ¹⁹ विस्तृत किया गया है.

हालांकि, इस दृष्टिकोण अपनी सीमाओं के बिना नहीं है. लाइव अलग NBs इमेजिंग के लिए कई निरंतर कर रहे हैं. छितरी कोशिकाओं के एक क्षेत्र में, उदाहरण के लिए, यह स्थानिक बरकरार मस्तिष्क ¹ में आयोजित कर रहे हैं कि विशिष्ट नायब प्रजातियों की पहचान करने के लिए मुश्किल है. इसी तरह, प्रकार अलग ऊतक के भीतर द्वितीय NBs बनाम प्रकार मैं भेद ऐसे worniu-GAL4, asense-GAL80 ²⁰ के रूप में वंश tracers या subtype विशेष transgenes, की अभिव्यक्ति के बिना भी चुनौती दे रहा है. इन transgenes कुछ अनुप्रयोगों के लिए काफी उपयोगी हैं, वे उन transgenes पूर्व करने के लिए शोधकर्ताओं को सीमित करते हैंयूएएस बढ़ाने तत्व ²¹ के नियंत्रण में दबाया और अधिक जटिल आनुवंशिक योजनाओं की आवश्यकता होती है. NBs के स्थानिक या अस्थायी विकास को चिंता है कि अध्ययन, इसलिए, एक अक्षुण्ण ऊतक के संदर्भ में vivo इमेजिंग में आवश्यकता होती है.

इसके अलावा, अलग भ्रूण NBs की पढ़ाई कुंजी polarity के अंतरावस्था स्थानीयकरण ^{22, 23} निर्धारकों के लिए आसन्न कोशिकाओं के शारीरिक संपर्क के लिए महत्वपूर्ण है कि संकेत मिलता है. इन अध्ययनों से पूरी तरह से अलग NBs अब कोई अपरिवर्तनीय mitotic धुरा धुरी बनाए रखने दिखा. इसके बजाय, इन कोशिकाओं को शायद कारण शिखर तारककाय स्थिति ²² के नुकसान के लिए एक अधिक यादृच्छिक धुरी धुरी और लगातार जीएमसी कलियों के बीच अलगाव की व्यापक कोण प्रदर्शित करते हैं. लार्वा NBs और उनके पड़ोसी की कोशिकाओं के बीच के रिश्ते बड़े पैमाने पर अध्ययन नहीं किया गया है, यह लार्वा स्टेम सेल microenvironment सेल polarity या अन्य पर टकराना सकता है कि विचार के लायक हैव्यवहार. लार्वा NBs के शारीरिक संदर्भ बनाए रखने के लिए, पूरे दिमाग से हम छवि एसीडी.

इमेजिंग अलग NBs के साथ जुड़े निहित सीमाओं को देखते हुए, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों को पूरी लार्वा दिमाग से नायब एसीडी की छवि लगातार राउंड के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की है. छवि बरकरार दिमाग के लिए तकनीकों अक्सर ऊतक विकृति या नुकसान को रोकने और गैस आदान प्रदान के लिए अनुमति देने के लिए एक लचीला झिल्ली के साथ संस्कृति कक्ष के एक तरफ कांच की कठोर सतह जगह. कुछ तरीकों कीट संवर्धन मध्यम, सीरम, और दस लार्वा ²⁴ से पृथक वसा शरीर के साथ एस्कॉर्बिक एसिड का एक मिश्रण में explanted दिमाग बढ़ते शामिल है. वे नायब कोशिका विभाजन ²⁵ को प्रोत्साहित करने के लिए जाना जाता माइटोजन छिपाना क्योंकि पृथक वसा शरीर से जोड़ रहे हैं. इस प्रोटोकॉल पर 3 घंटे के लिए ऊतक की अखंडता को बरकरार रखता है और लंबे समय तक इमेजिंग ^{24, 26-28} के लिए उत्तरदायी है, इसलिए. हाल ही में, लंदन का वर्णन एक प्रोटोकॉलएस्कॉर्बिक एसिड, सीरम, और वसा शरीर की उपस्थिति में बरकरार लार्वा दिमाग की जी अवधि इमेजिंग ²⁹ विस्तृत किया गया है. ऊतक उजागर न ही स्थिर है क्योंकि न तो महत्वपूर्ण बात है,, इस दृष्टिकोण संवर्धन मध्यम विमर्श किया है जहां अनुप्रयोगों के लिए कम उपयोगी है (आदि जैसे, दवा पढ़ाई, immunodepletion,.).

हमारी प्रयोगशाला लंबी अवधि इमेजिंग ^{30, 31} के लिए लाइव लार्वा दिमाग के पूरे माउंट तैयारी सरल बनाया गया है. दूसरों पर हमारे प्रोटोकॉल के मुख्य लाभ अपनी सादगी है: हमारी टिप्पणियों नायब एसीडी की छवि लगातार राउंड के लिए आवश्यक additives हैं न तो सीरम, एस्कॉर्बिक एसिड, इंसुलिन, और न ही वसा शरीर से संकेत मिलता है. ऐसे इंसुलिन के रूप में additives, स्टेम सेल डिवीजनों ^{में 32} और ड्रोसोफिला अंडाशय ³³ में सामूहिक सेल प्रवास के लंबे समय तक इमेजिंग के लिए उपयोगी किया गया है हालांकि हमारे इमेजिंग के माध्यम स्टेशन के एक साधारण मिश्रण के होते हैं, के रूप में वे, नायब एसीडी के लिए नगण्य होना दिखाई देते हैंndard कीट कोशिका संवर्धन मध्यम प्रदूषण को रोकने के लिए एंटीबायोटिक कवकनाशी के साथ पूरक. पुन: प्रयोज्य गैस पारगम्य या गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन के उपयोग के माध्यम से, हम लगातार नायब सेना दंत चिकित्सा महाविद्यालय के कई दौर को बनाए रखने में सक्षम है. एक ही explanted नमूने आसानी immunofluorescence और तय ऊतक के साथ अन्य प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार बरकरार लार्वा दिमाग का विच्छेदन, साथ ही रहते हैं और तय दोनों के विश्लेषण के लिए दिमाग की तैयारी.

Protocol

1. आवश्यक सामग्री की तैयारी तीसरे instar लार्वा दिमाग explant को Microdissection के लिए आवश्यक उपकरण तैयार. पहले एक पिन धारक में एक भी विदारक पिन रखकर दो विदारक उपकरण (एक छुरी और एक हुक) बना. हाथ से या सरौता (चित्रा 1…

Representative Results

लाइव इमेजिंग नायब एसीडी कि विनियमित तंत्र के एक नंबर elucidated किया गया है. पिछले छवि अधिग्रहण करने के लिए, यह इष्टतम इमेजिंग की स्थिति निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. यह लाइव सेल इमेजिंग की अवधि के साथ फ्रे?…

Discussion

लाइव सेल इमेजिंग स्टेम कोशिकाओं की एसीडी, सेल प्रजातियों के भेदभाव को विनियमित कि तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक अमूल्य दृष्टिकोण, और जटिल ऊतकों के morphogenesis है. अनुसंधान समूहों ऐतिहासिक नायब एसी?…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.