Immagini dal vivo di<em> Drosophila</em> larvali neuroblasti

Summary

Dettagli Questo protocollo un metodo semplificato utilizzato per condurre cellule vive nel contesto di un cervello larvale intatto. Approcci di imaging cellulare dal vivo hanno un valore inestimabile per lo studio delle divisioni asimmetriche di cellule staminali neurali così come altri processi neurogena e di sviluppo, in coerenza scoprendo i meccanismi che sono stati precedentemente trascurato.

Abstract

Le cellule staminali si dividono asimmetricamente per generare due cellule progenie con disparità di potenziale destino: una cellula staminale auto-rigenerante e una cellula di differenziazione. Data la loro rilevanza per lo sviluppo e la malattia, la comprensione dei meccanismi che governano la divisione delle cellule staminali asimmetrica è stata una zona robusta di studio. Perché sono geneticamente trattabili e sottoposti a cicli successivi di divisione cellulare circa una volta ogni ora, le cellule staminali del sistema nervoso centrale Drosophila, o neuroblasti, sono modelli indispensabili per lo studio di divisione delle cellule staminali. Circa 100 cellule staminali neurali sono situati vicino alla superficie di ciascuno dei due lobi cerebrali larvali, rendendo questo sistema modello particolarmente utile per studi di microscopia imaging dal vivo. In questo lavoro, passiamo in rassegna diversi approcci ampiamente utilizzati per visualizzare le divisioni di cellule staminali, e ci rivolgiamo i relativi vantaggi e gli svantaggi di queste tecniche che impiegano dissociano contro i tessuti cerebrali intatti. Abbiamo anche il nostro particolare simplifprotocollo IED utilizzato per espiantare cervelli interi da larve terzo instar per l'imaging cellulare dal vivo e applicazioni di analisi fisse.

Introduction

Le cellule staminali mantenere un equilibrio di differenziazione e di auto-rinnovamento per generare diversità cellulare durante lo sviluppo iniziale e sostituire le cellule danneggiate nei tessuti adulti. Regolamentazione di tale omeostasi impedisce sia la perdita e eccessiva espansione della popolazione di cellule staminali, che può provocare la degenerazione dei tessuti deleterio o tumorigenesi.

Neuroblasti (NBS) sono le cellule staminali neurali ampiamente studiati del sistema Drosophila nervoso centrale (Figura 1A), che prima forma durante le fasi embrionali ^{1, 2.} NBs sottoposti a ripetuti cicli di divisione cellulare asimmetrica (ACD) per produrre due cellule inegualmente fatidici: una cellula staminale auto-rinnovare e una cella di differenziazione. ACD è guidata dai centrosomi, gli organelli non membranose che fungono da centri di microtubuli organizzazione della maggior parte delle cellule ^3. Durante la mitosi, centrosomi NB organizzano e orientano il fuso mitotico bipolare lungo la polare apicale-basaleAsse lità. Dopo la scissione della divisione NB, determinanti destino apicali che specificano il destino delle cellule staminali, e determinanti destino basali che specificano la differenziazione, sono segregati nelle cellule figlie disuguali.

Nel cervello centrale larvale, due tipi di NBs si distinguono per il loro numero, posizione, espressione del fattore di trascrizione, e la linea cellulare (Figura 1A) ^4-6. Tipo I NBs sono il più abbondante, e circa 90 di essi popolano i lati anteriore e posteriore di ciascun lobo ottica del cervello ^7. Questi NBs esprimono il fattore di trascrizione Asense (Ase), e tipicamente dividono in una auto-rinnovo NB e un ganglio cella più piccola madre (GMC; Figura 1B). Ogni GMC subisce una sola divisione terminale per generare due neuroni o glia (Figura 1B). Al contrario, la Banca nazionale slovacca otto di tipo II che popolano il lato posteriore di ciascun lobo ottico mancano espressione Ase ^5. Subiscono ACDper produrre un NB auto-rigenerante e un progenitore neuronale intermedio (INP).

Il INP, a sua volta, divide asimmetricamente tre a cinque volte. Ciascuna di queste divisioni risultati nella rigenerazione del INP e la produzione di un singolo GMC ^4. Collettivamente, l'identità specifica NB e l'ordine temporale di GMC nascita dà origine alla diversità stupefacente neuronale del sistema nervoso centrale adulto.

Capire la biologia cellulare che è alla base NB ACD è stata notevolmente migliorata attraverso l'uso di tecniche di imaging cellulare dal vivo. Protocolli pubblicati utilizzate dai ricercatori per l'immagine NBs dal vivo variano molto. Nel complesso, tuttavia, questi metodi possono essere raggruppate in due categorie generali che si distinguono per se il cervello larvale è lasciata intatta o meccanicamente dissociato. Entrambe le tecniche presentano vantaggi e svantaggi a seconda dell'applicazione del ricercatore.

I primi rapporti che rivelano in tempo reale divisione cellulare NBsioni implicano un certo grado di dissociazione manuale del cervello larvale. Questi protocolli dettaglio sbavature ⁸ o prendere in giro a parte ⁹ il cervello per crescere colture primarie a breve termine della NBs su vetrini. Per migliorare l'imaging, la Banca nazionale slovacca rotondo di solito sono appiattiti sulle coprioggetto sia con vetrini ⁸ o pad agarosio ^9. Sebbene le cellule appiattite hanno migliorato ottica, queste tecniche spesso portano a difetti mitotici NB, compreso regressione del solco scissione e l'incapacità di dividere più di una volta. Pertanto, i protocolli che coinvolgono sia dissociazione manuale e distorsione fisica del tessuto cerebrale larvale sono generalmente adatti solo a brevissimo termine (cioè., Un ciclo di cella o meno) applicazioni. Allo stesso modo, semi-schiacciamento o appiattire completamente il cervello intatto fra vetrini e vetrini limita il tempo si può trascorrere l'imaging un dato campione, ad un periodo di circa 30 min ^10. Nonostante questa limitazione, this approccio è stato utilizzato con successo ^11-14.

I recenti sforzi di immagine dal vivo dissociate limite NBs distorsione fisica delle cellule isolate. Queste tecniche sono particolarmente utili per applicazioni in cui è necessario sostenere colture cellulari per più cicli di divisione cellulare. Per esempio, le cellule disperse dal cervello dissociate manualmente possono essere parzialmente incorporati in un coagulo ottenuto dalla miscela di fibrinogeno e trombina ¹⁵ per l'imaging a lungo termine ^16. In alternativa, possono essere espiantati cervelli primo dissociato chimicamente con l'enzima collagenasi, accanto interrotto manualmente ripetuto passaggio attraverso una punta di pipetta, e successivamente placcato su poli-L-lisina rivestite con vetro piatti inferiori ^{17, 18.} Rivestimento piatti di vetro o con fibrinogeno o poli-L-lisina favorisce l'attaccamento e leggero diffusione delle cellule rotonde, portando loro il più vicino al vetrino possibile senza grave distorsione fisica. In additisu, questi metodi comportano coltura NBS in mezzo che può essere facilmente scambiato per esperimenti farmacologici perturbativi ^18. Nel complesso, placcatura direttamente dispersi NBs migliora l'ottica delle immagini senza sacrificare la funzionalità di imaging a lungo termine. Recentemente, un protocollo che descrive la coltura a lungo termine di dissociata NBs è stato dettagliato ^19.

Tuttavia, questo approccio non è privo di limiti. Ci sono diversi avvertimenti all'imaging NBs vivo dissociate. In un campo di cellule disperse, per esempio, è difficile identificare specifici lignaggi NB che sono spazialmente organizzati nel cervello intatto ^1. Allo stesso modo, distinguendo il tipo I rispetto al tipo NBs II all'interno del tessuto dissociato è anche una sfida, senza l'espressione di traccianti lignaggio o transgeni specifico sottotipo, come worniu-GAL4, asense-GAL80 ^20. Sebbene questi transgeni sono molto utili per alcune applicazioni, che limitano ricercatori a quelli transgeni expremuto sotto il controllo dell'elemento UAS enhancer ²¹ e richiedono regimi genetiche più complesse. Gli studi che riguardano lo sviluppo spaziale o temporale di NBs, quindi, richiedono imaging in vivo nel contesto di un tessuto intatto.

Inoltre, studi di NBs embrionali dissociate indicano che il contatto fisico di celle adiacenti è critica per la localizzazione interfase di polarità chiave determinanti ^{22, 23.} Questi studi mostrano completamente isolato NBs mantenere più l'asse mitotico mandrino invariante. Invece, queste cellule mostrano un più randomizzati asse mandrino e ampi angoli di separazione tra gemme successive GMC, forse a causa della perdita di posizionamento apicale centrosome ^22. Anche se il rapporto tra i NBs larvali e le loro cellule vicine non è stato ampiamente studiato, vale la pena considerare che il larvale microambiente delle cellule staminali potrebbe ricadere su polarità cellulare o altrocomportamenti. Per mantenere il contesto fisiologico di larve NBs, abbiamo un'immagine ACD da cervelli interi.

Dati i limiti intrinseci associati a immagini dissociato NBs, il nostro laboratorio e altri hanno stabilito protocolli per immagine cicli successivi di NB ACD da interi cervelli larvali. Tecniche all'immagine cervello integro spesso sostituiscono la superficie rigida di vetro su un lato della camera di coltura con una membrana flessibile per evitare la distorsione del tessuto o danneggiamento e consentire lo scambio di gas. Alcuni metodi coinvolgono montaggio cervelli espiantati in una miscela di insetto mezzo di coltura, il siero, e acido ascorbico con i corpi grassi isolati da dieci larve ^24. I corpi grassi isolati vengono aggiunti perché secernono un mitogeno nota per stimolare la divisione cellulare NB ^25. Questo protocollo preserva l'integrità del tessuto per oltre 3 ore ed è, quindi, suscettibili di immagini a lungo termine ^{24, 26-28.} Recentemente, un protocollo che descrive la lonImaging g-termine intatte cervelli larvali in presenza di acido ascorbico, siero, e corpi grassi è stato dettagliato ^29. Importante, perché il tessuto non è né esposto né immobilizzato, questo approccio è meno utile per applicazioni in cui viene scambiato medio di coltura (per esempio, studi di droga, immunodeplezione, ecc.).

Il nostro laboratorio ha semplificato tutta la preparazione monte di cervelli larvali vivi per l'imaging a lungo termine ^{30, 31.} Il vantaggio principale per il nostro protocollo sugli altri è la sua semplicità: le nostre osservazioni indicano né sierica, acido ascorbico, l'insulina, né corpi grassi sono additivi necessari a immagine cicli successivi di NB ACD. Sebbene additivi, come l'insulina, sono stati utili per l'imaging prolungato di divisioni cellulari staminali ³² e la migrazione delle cellule collettivo in Drosophila ovaie ^33, sembrano essere indispensabili per NB ACD, come il nostro mezzo di imaging consiste in una semplice miscela di standard insetto mezzo di coltura cellulare integrato con antibiotico-antimicotico per prevenire la contaminazione. Attraverso l'uso di piatti della cultura di fondo del gas-permeabili o vetro riutilizzabili, siamo stati in grado di sostenere diverse fasi di successivi NB ACD. Gli stessi campioni espiantati facilmente utilizzabile per immunofluorescenza e altre procedure con tessuto fissato. In questo protocollo, si dettaglio la dissezione di cervelli larvali intatte, così come la preparazione di cervello per l'analisi sia vivo e fisso.

Protocol

1. Preparazione dei materiali necessari per espianto Brains al terzo stadio larvali Preparare gli strumenti necessari per microdissezione. Forge due strumenti di dissezione (un bisturi e un gancio) in primo luogo mettendo un unico perno dissezione in ciascun supporto del perno. Assicurare le spine saldamente a mano o con pinze (Figura 1C). Utilizzare un paio di vecchie pinze per piegare un pin dissezione ad un angolo di circa 120 °. Eseguire questa sotto un microscopio da …

Representative Results

Immagini dal vivo ha chiarito una serie di meccanismi che regolano NB ACD. Prima di acquisizione delle immagini, è necessario determinare le condizioni ottimali di imaging. È necessario bilanciare la velocità di acquisizione cornice con la durata di cellule vive. Per l'analisi cellulare fine, per esempio, l'aumento temporale e può essere richiesto risoluzione ottica. Quando visualizzare un singolo ciclo cellulare NB (Figura 4A), la velocità con cui le immagini vengono catturate può essere …

Discussion

Imaging cellulare dal vivo è un approccio prezioso utilizzato per studiare i meccanismi che regolano ACD delle cellule staminali, la differenziazione delle linee cellulari, e la morfogenesi dei tessuti complessi. Sebbene gruppi di ricercatori hanno storicamente impiegato una varietà di tecniche per visualizzare NB ACD, questi approcci possono generalmente essere raggruppate in due categorie che differiscono principalmente per quanto riguarda se il tessuto cerebrale è lasciata intatta o dissociata.

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Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.