의 라이브 영상<em> 초파리</em> 애벌레 Neuroblasts

Summary

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

Abstract

자기 갱신 줄기 세포와 분화 세포 : 줄기 세포는 불균등 운명 잠재력이 자손 세포를 생성하는 비대칭으로 나눈다. 비대칭 줄기 세포 분열이 연구의 강력한 지역이었다 지배하는 메커니즘을 이해, 개발 및 질병의 관련성을 감안할 때. 그들은 유 전적으로 다루기 쉬운이며, 대한 시간마다 세포 분열의 연속 라운드를 받아야하기 때문에, 초파리의 중추 신경계, 또는 neuroblasts의 줄기 세포는 줄기 세포 부문의 연구에 필수적인 모델입니다. 약 100 신경줄 기세포는 라이브 영상 현미경 연구를위한 모델 시스템이 특히 유용하게,이 유충 두뇌 돌출부의 각각의 표면 근처에 위치되어있다. 이 작품에서 우리는 널리 줄기 세포의 분열을 시각화하는 데 사용되는 여러 가지 방법을 검토하고, 우리는 상대적으로 장점을 그대로 뇌 조직에 비해 해리 고용한다 그 기술의 단점을 해결합니다. 또한, 우리는 우리의 simplif처음 엔 프로토콜은 라이브 셀 이미징을위한 제 령 애벌레 고정 분석 응용 프로그램에서 전체 두뇌를 이식편하는 데 사용됩니다.

Introduction

줄기 세포는 초기 발달 동안 세포 다이버 시티를 생성하고 성인 조직에서 손상된 세포를 대체하는 분화의 균형과 자기 갱신을 유지한다. 이 항상성의 규정은 손실과 해로운 조직의 변성 또는 종양이 발생할 수 있습니다 줄기 세포 인구의 이상 팽창을 모두 방지 할 수 있습니다.

Neuroblasts (NBS)은 초파리의 중추 신경계 (그림 1A) 배아 단계 ^{1, 2} 중 그 첫 번째 양식의 널리 연구 신경 줄기 세포입니다. 자기 갱신 줄기 세포와 분화 세포 : NBS는 두 불평등 운명 세포를 생산하는 비대칭 세포 분열 (ACD)의 반복 라운드를 받고있다. ACD는 중심체, 대부분의 세포 ^3의 미세 소관 조직 센터의 역할이 아닌 막 세포 기관에 의해 인도된다. 유사 분열 동안, NB의 중심체 구성하고 혀끝 – 기초 극성에 따라 양극 분열 스핀들의 방향을ITY 축. 분할 NB의 분열에, 줄기 세포의 운명을 지정 혀끝의 운명을 결정하고, 차별화를 지정 기초의 운명의 결정은, 불평등 한 딸 세포로 분리된다.

유생 중앙 뇌, NBS 두 종류의 그들의 수, 위치, 전사 인자의 발현 및 세포 계보 (도 1a) ^4-6에 의해 구별 될 수있다. I NBS는 가장 풍부한 입력하고 약 90 그들의 두뇌 ^7의 각 광 엽의 전방 및 후방 측면을 채 웁니다. 이 NBS는 전사 인자 Asense (아세)를 표현하고 그들은 특징적으로 하나의 자기 갱신 NB로 나누어 하나의 작은 신경절 어머니 세포 (GMC, 그림 1B). 각 GMC는 두 개의 신경 세포 나 교세포 (그림 1B)를 생성 할 수있는 하나의 단말기 부문을 겪는다. 반면, 각 광 엽의 후방 측을 채울 여덟 유형 II NBS는 아세 식 ^{5 부족합니다.} 그들은 ACD를 받아야하나의 자기 갱신 NB와 하나의 중간 신경 전구 (INP)를 생성한다.

INP, 차례로, 비대칭으로 3-5 회 분할한다. INP의 재생 및 단일 GMC ^(4)의 생산에서 이러한 구분 결과의 각. 공동으로, 특정 NB의 정체성과 GMC의 출생의 시간 순서는 성인 중추 신경계의 신경 세포의 놀라운 다양성에 상승을 제공합니다.

NB ACD의 기초가되는 세포 생물학이 크게 라이브 셀 이미징 기술의 사용을 통해 향상되었습니다 이해. 이미지 라이브 NBS를 사용하여 연구자 게시 프로토콜은 매우 다양. 전반적으로, 그러나, 이러한 방법은 유충의 두뇌가 그대로 유지 또는 기계적으로 분해되어 있는지 여부를 구별 두 가지 일반적인 범주로 분류 할 수있다. 두 기술은 연구원의 응용 프로그램에 따라 각각 장단점이 있습니다.

라이브 NB 세포 디비를 공개 초기 보고서sions는 애벌레 뇌의 수동 해리의 어느 정도를 포함한다. 이러한 프로토콜 세부 사항은 ^{8 번짐이나} 유리 커버 슬립에 NBS의 단기 차 문화를 성장하기 위해 떨어져 ⁹ 뇌를 괴롭 히고. 이미지를 개선하기 위해 라운드 NBS는 일반적으로 유리 슬라이드 ⁸ 또는 아가로 오스 패드 ⁽⁹⁾ 중 하나와 함께 커버 슬립에 평평하게됩니다. 편평 세포 광학을 개선하고 있지만, 이들 기술들은 분열 밭고랑의 회귀 하나 이상의 시간을 나눌 수 없다는 등, NB의 유사 분열 결함으로 이어질. 따라서, 수동 해리 애벌레 뇌 조직의 물리적 변형을 모두 포함하는 프로토콜은 일반적으로 단지 매우 짧은 기간 (예., 하나의 세포주기 이하) 응용 프로그램에 적합합니다. 마찬가지로, 반 부수 또는 완전히 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이에 그대로 머리를 평평 하나는 약 30 분 동안 ¹⁰ 주어진 표본 이미징 보낼 수있는 시간을 제한합니다. 이 제한, 생에도 불구하고발 접근법은 성공적 ^11-14 사용되고있다.

이미지 라이브의 최근 노력은 NBS 제한에게 고립 된 세포의 물리적 왜곡 해리. 이러한 기술은 여러 세포 분열주기를 세포 배양을 유지하기 위해 필요한 애플리케이션에 특히 유용하다. 예를 들어, 수동으로 해리 두뇌에서 분산 된 세포는 부분적 장기 촬상 ¹⁶ 피브리노겐과 트롬빈 ^(15)의 혼합물로부터 만들어 응고에 내장 될 수있다. 또한, 외식 뇌는 화학적으로 효소 다음 수동으로 피펫 팁을 통해 반복 통과에 의해 방해 콜라, 이후에 폴리-L-라이신 코팅 유리 바닥 요리 ^{(17, 18)에} 도금 해리 첫 번째가 될 수 있습니다. 피브리노겐 또는 폴리-L-라이신 하나와 유리 접시를 코팅하는 주요 물리적 왜곡없이 가능한 커버 슬립에 그들을 가까이 가져, 둥근 세포의 확산을 첨부하고 약간을 촉진합니다. 책상 외에도에서에 이러한 방법이 쉽게 약물 섭동 실험 ^18으로 교환 할 수있다 매체에 NBS를 배양 포함한다. 전반적으로, 직접 도금 NBS 장기 이미징 기능을 희생하지 않고 이미징 광학 향상 분산. 최근, 해리 NBS의 장기간 배양을 기술 프로토콜 ^(19)을 자세히 설명하고있다.

그러나, 이러한 접근은 그 한계가없는 것은 아니다. 라이브 해리 NBS 이미징 몇 가지주의 사항이 있습니다. 분산 된 세포의 분야에서, 예를 들어, 공간적으로 손상 뇌 ^일이 구성되어 특정 NB 계통을 식별하는 것이 곤란하다. 마찬가지로, 유형 해리 조직 내 II NBS 대 유형 I를 구분하는 것은 이러한 worniu-GAL4, asense-GAL80 ²⁰ 계보 추적자 또는 서브 타입 별 도입 유전자의 발현없이도 도전. 이러한 형질 전환 유전자가 일부 응용 프로그램에 매우 유용하지만, 그들은 그 형질 전환 유전자의 예에 연구원을 제한 않는다UAS 인핸서 요소 ^(21)의 제어하에 가압 유전 복잡한 구조를 필요로하기 때문이다. NBS의 공간 또는 시간 발전을 염려 연구는, 따라서 조직 손상의 문맥에서 생체 내 이미징에 요구한다.

또한, 해리 배아 NBS의 연구는 키 극성의 계면 지역화 ^{22, 23} 결정에 인접한 셀의 물리적 접촉이 중요하다는 것을 나타냅니다. 이러한 연구는 완전히 격리 NBS가 더 이상 고정 유사 분열 스핀들 축 유지되지 보여준다. 대신에,이 세포는 아마도 인해 혀끝의 중심체 위치 ^(22)의 손실을 더 무작위 스핀들 축 연속 GMC 싹을 분리, 넓은 각도를 표시합니다. 유생 NBS와 그 이웃하는 셀 사이의 관계를 광범위하게 연구되지 ​​않았지만, 그것은 유생 줄기 세포 미세 환경은 세포 또는 다른 극성에 충돌 할 수 있음을 고려할 가치가있다행동. 유생 NBS의 생리적 컨텍스트를 유지하기 위하여, 전체 뇌에서 우리 화상 ACD.

영상 해리 NBS와 관련된 제한 사항을 감안할 때, 우리의 실험실과 다른 사람은 전체의 애벌레의 뇌에서 NB ACD의 이미지를 연속 라운드에 프로토콜을 설립했다. 이미지 그대로 뇌에 기술들은 조직의 왜곡이나 손상을 방지하고 가스 교환을 허용하는 유연한 막과 문화 실의 한쪽에 유리의 단단한 표면을 교체합니다. 일부 방법은 곤충 배양 배지, 혈청 및 열 유충 ^{(24)로부터} 격리 지방 기관과 아스코르브 산의 혼합물에 외식 뇌 장착 포함한다. 그들은 NB 세포 분열 ^(25)을 자극하는 것으로 알려진 유사 분열 물질을 분비하기 때문에 격리 된 지방 기관이 추가됩니다. 이 프로토콜은 3 이상의 시간 동안 조직의 무결성을 유지하고 장기간 촬상 ^{24, 26-28} 의무, 그러므로,이다. 최근, LON을 기술 프로토콜아스 코르 빈산, 혈청, 지방 기관의 존재 그대로 애벌레 두뇌의 G-기간 이미징은 ²⁹ 자세히 설명하고있다. 조직이 노출되거나 고정되지도 있기 때문에 중요한 것은,이 방법은 배양 배지를 교환 응용 프로그램에 덜 유용하다 (등 예를 들면, 약물 연구, immunodepletion.).

우리 연구소는 장기 이미징 ^{30, 31 일에} 대한 살아있는 애벌레 두뇌의 전체 마운트 준비를 간단하게했다. 다른 사람에 우리의 프로토콜의 주요 장점은 단순하다 : 우리의 관측은 NB ACD의 이미지를 연속 라운드에 필요한 첨가제입니다도 혈청, 아스 코르 빈산, 인슐린, 또는 지방 기관을 나타냅니다. 인슐린 등의 첨가제는, 줄기 세포 분열 ^(32)와 초파리의 난소 ⁽³³⁾ 집단 세포 이동의 장시간 촬영에 유용되어 있지만 우리의 영상 매체는 역의 단순한 혼합물로 구성되어, 그들은, NB ACD 비용 소비로 표시ndard 곤충 세포 배양 배지는 오염을 방지하기 위하여 항생제가 보충 항진균. 재사용 할 수있는 가스 투과성이나 유리 바닥 문화 요리의 사용을 통해, 우리는 연속 NB ACD에 몇 차례를 유지할 수 있었다. 같은 외식 샘플은 쉽게 면역 고정 조직과 다른 절차를 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 세부 그대로 애벌레 뇌의 해부뿐만 아니라 라이브 및 고정 모두 분석을위한 두뇌의 준비.

Protocol

1. 필요한 재료의 제조는 세 번째 탈피 애벌레의 머리를 이식​​편하기 미세 절제에 필요한 도구를 준비합니다. 먼저 각 핀 홀더에 하나의 해부 핀을 배치하여 두 해부 도구 (메스와 훅)를 위조. 손으로 또는 플라이어 (그림 1C)와 긴밀하게 핀을 고정합니다. 약 120 °의 각도로 하나 해부 핀이 구부러 이전 포셉 한 쌍을 사용합니다. 핀 홀더가 손에 개최 될 때 핀의…

Representative Results

라이브 영상은 NB ACD를 조절 메커니즘의 숫자를 해명했다. 종래 이미지 수집하기 위해서는, 최적의 촬상 조건을 결정하는 것이 필요하다. 이 생균의 촬상 기간과 프레임 캡쳐 율을 양립시킬 필요가있다. 미세 세포 분석을 위해, 예를 들어, 일시적인 증가 및 광학 해상도가 요구 될 수있다. 단일 NB 세포주기 (도 4a)를 시각화하는 경우, 이미지가 캡처되는 속도는 광 손상을 도입하지 않고…

Discussion

라이브 세포 이미징은 줄기 세포의 ACD, 세포 계통의 분화를 조절하는 메커니즘을 연구하는 데 귀중한 방법, 복잡한 조직의 형태 형성이다. 연구 그룹은 역사적 NB ACD를 시각화하는 다양한 기술을 채택하고 있지만, 이러한 방법은 일반적으로 주로 뇌 조직은 그대로 유지 또는 해리되어 있는지 여부에 대하여 다른 두 가지 범주로 분류 될 수있다.

영상은 NBS는 장점을 가지고 해?…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.