Imagens ao vivo de<em> Drosophila</em> larval Neuroblastos

Summary

Este protocolo detalha um método simplificado utilizado para conduzir imagem de células vivas, no contexto de um cérebro de larvas intacta. Abordagens imagens de células vivas são de valor inestimável para o estudo de células-tronco neurais divisões assimétricas, bem como outros processos neurogênicas e de desenvolvimento, de forma consistente descobrir mecanismos que anteriormente eram negligenciados.

Abstract

As células-tronco se dividem de forma assimétrica para gerar duas células de progênie com desigual potencial destino: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação de uma célula. Dada a sua relevância para o desenvolvimento e da doença, compreender os mecanismos que regem a divisão de células-tronco assimétrico tem sido uma área forte de estudo. Porque eles são geneticamente tratável e submetidos a ciclos sucessivos de divisão celular uma vez a cada hora, as células estaminais do sistema nervoso central, de Drosophila, ou neuroblastos, são modelos indispensáveis ​​para o estudo da divisão de células estaminais. Cerca de 100 células estaminais neurais estão localizadas próximo da superfície de cada um dos dois lobos cerebrais larvais, tornando este sistema modelo particularmente útil para estudos de microscopia de imagens em tempo real. Neste trabalho, nós revisamos várias abordagens amplamente utilizado para visualizar as divisões de células-tronco, e abordar as vantagens e desvantagens relativas as técnicas que empregam dissociados contra tecidos cerebrais intactas. Nós também detalhar nossa simplifprotocolo IED usado explantar cérebros inteiros a partir de larvas de terceiro estádio de imagens de células vivas e aplicações de análise fixos.

Introduction

As células-tronco manter um equilíbrio de diferenciação e auto-renovação para gerar diversidade celular durante o desenvolvimento precoce e substituir as células danificadas em tecidos adultos. A regulação deste homeostase impede tanto a perda como sobre-expansão da população de células estaminais, o que pode resultar em degeneração de tecido nocivo ou tumorigénese.

Os neuroblastos (RN), são as células estaminais neurais amplamente estudadas do sistema nervoso central de Drosophila (Figura 1A), que durante a primeira forma estágios embrionários ^{1, 2.} RN submetidos a repetidos ciclos de divisão celular assimétrica (ACD) para produzir duas células desigualmente predestinadas: uma célula-tronco auto-renovação e diferenciação celulares. ACD é guiado por centrossomas, as organelas não-membranosas que atuam como centros de microtúbulos-organização da maioria das células ^3. Durante a mitose, centrossomas NB organizar e orientar o fuso mitótico bipolar ao longo do apical-basal polareixo dade. Após a clivagem da NB dividindo, determinantes destino apicais que especificam o destino de células-tronco, e determinantes destino basais que especificam diferenciação, são segregados em células filhas desiguais.

No cérebro central larvar, dois tipos de RNs podem ser distinguidas pelo seu número, posição, expressão do factor de transcrição, e da linhagem de células (Figura 1A) ^4-6. Tipo I RN são os mais abundantes, e cerca de 90 deles preencher os anteriores e posteriores lados de cada lóbulo óptico do cérebro ^7. Estes RN expressar o fator de transcrição Asense (ASE), e eles caracteristicamente se dividem em uma auto-renovação NB e um menor célula-mãe gânglio (GMC; Figura 1B). Cada GMC passa por uma única divisão terminal para gerar dois neurônios ou células gliais (Figura 1B). Em contraste, os RN oito do tipo II que povoam o lado posterior de cada lobo óptico falta Ase expressão ^5. Eles sofrem ACDpara produzir um NB auto-renovação e um progenitor neural intermediária (INP).

O INP, por sua vez, divide assimetricamente três a cinco vezes. Cada uma dessas divisões conduz à regeneração do INP e a produção de um único GMC ^4. Colectivamente, a identidade específica NB e a ordem temporal de GMC nascimento dá origem à diversidade surpreendente neuronal do sistema nervoso central adulto.

Compreender a biologia das células que subjaz NB ACD foi vastamente melhorada através do uso de técnicas de imagem de células vivas. Publicado protocolos utilizados pelos pesquisadores para a imagem RN ao vivo variam muito. Em geral, no entanto, estes métodos podem ser agrupados em duas categorias gerais que se distinguem pelo facto do cérebro larval é deixada intacta ou mecanicamente dissociadas. Ambas as técnicas apresentam vantagens e desvantagens distintas, dependendo da aplicação do pesquisador.

Os primeiros relatos revelam divi célula NB ao vivoes envolvem um certo grau de dissociação Manual do cérebro larval. Estes protocolos detalhes manchas ⁸ ou ⁹ provocando além do cérebro, a fim de crescer culturas primárias de curto prazo do RN em lamínulas. Para melhorar a imagem, os RN redondas são geralmente achatado nas lamelas em que suas lâminas de vidro ⁸ ou almofadas de agarose ^9. Embora as células achatadas têm melhorado óptica, estas técnicas conduzem frequentemente a defeitos mitóticas RN, incluindo a regressão do sulco de clivagem e a incapacidade para se dividem mais do que uma vez. Por conseguinte, os protocolos que envolvem a dissociação manual e distorção física do tecido cerebral de larvas são geralmente apenas adequados para a muito curto prazo (isto é., Um ciclo de célula ou menos) aplicações. Da mesma forma, semi-esmagamento ou achatamento completamente cérebros intactos entre lâminas de vidro e lamelas limita o tempo pode-se passar a imagem de um dado espécime para um período de ¹⁰ minutos, aproximadamente, 30. Apesar desta limitação, this abordagem tem sido utilizada com sucesso ^11-14.

Esforços recentes para a imagem ao vivo dissociada limite RN distorção física das células isoladas. Estas técnicas são particularmente úteis para aplicações em que é necessária para sustentar a culturas de células de múltiplos ciclos de divisão celular. Por exemplo, as células dispersas do cérebro dissociados manualmente pode ser parcialmente incorporado num coágulo feita a partir da mistura de fibrinogénio e trombina ¹⁵ para geração de imagens de longo prazo ^16. Alternativamente, os cérebros explantados pode ser primeiro quimicamente dissociados com a enzima colagenase, próximo interrompido manualmente, por passagem repetida através de uma ponta de pipeta, e subsequentemente semeadas em poli-L-lisina-revestidas de vidro pratos de fundo ^{17, 18.} Revestimento pratos de vidro com ou fibrinogênio ou poli-L-lisina promove o anexo e leve disseminação de células redondas, trazendo-o mais próximo da lamela quanto possível, sem grande distorção física. Em comum, alémem, estes métodos envolvem a cultura da RN em meio que pode ser facilmente trocado por experimentos de perturbação farmacológicas ^18. No geral, chapeamento diretamente dispersa RN melhora óptica de imagem sem sacrificar a capacidade de imagem de longo prazo. Recentemente, um protocolo descrevendo a cultura de longo prazo de dissociada RN foi detalhado ^19.

No entanto, esta abordagem não é sem as suas limitações. Existem várias ressalvas à imagem RN ao vivo dissociados. Num campo de células dispersas, por exemplo, é difícil identificar linhagens NB específicos que são espacialmente organizadas no cérebro intacto ^1. Da mesma forma, distinguir o tipo I versus Tipo II RN no tecido dissociado é também um desafio, sem a expressão de marcadores de linhagem ou transgenes específicos do subtipo, como worniu-GAL4, asense-GAL80 ^20. Embora esses transgenes são bastante úteis para algumas aplicações, eles não limitam aos investigadores transgenes expressionado sob o controlo do elemento intensificador UAS ²¹ e exigem sistemas genéticos mais complexos. Estudos que dizem respeito ao desenvolvimento espacial ou temporal de RN, portanto, exigem in vivo de imagens no contexto de um tecido intacto.

Além disso, estudos de RN embrionárias dissociadas indicam que o contacto físico das células adjacentes é crítica para a localização da interfase de polaridade chave determinantes ^{22, 23.} Esses estudos mostram completamente isolado RN não mais manter o eixo do fuso mitótico invariante. Em vez disso, estas células apresentam um eixo de fuso mais aleatórios e largos ângulos de separação entre as sucessivas gomos GMC, talvez devido à perda de apicais posicionamento centrossoma ^22. Embora a relação entre os RN de larvas e suas células vizinhas não tem sido extensivamente estudada, vale a pena considerar que o microambiente de células-tronco larval pode invadir a polaridade celular ou outrocomportamentos. Para manter o contexto fisiológico de larvas RN, que imagem a partir de cérebros inteiros de ACD.

Dadas as limitações inerentes a imagem dissociada RN, o nosso laboratório e outras estabeleceram protocolos de imagem sucessivas rondas de NB ACD de cérebros larvas inteiras. Técnicas para a imagem cérebros intactos, muitas vezes substituir a superfície rígida de vidro de um lado da câmara de cultura com uma membrana flexível, para evitar a distorção do tecido ou danos e para permitir a troca de gás. Alguns métodos envolvem a montagem cérebros explantados em uma mistura de meio de insecto de cultura, soro, e ácido ascórbico com os corpos gordos isolados a partir de dez larvas ^24. Os corpos gordos isolados são adicionados porque eles secretam um mitógeno conhecido por estimular a divisão celular NB ^25. Este protocolo preserva a integridade do tecido por mais de 3 horas e é, por isso, passíveis de imagens de longo prazo ^{24, 26-28.} Recentemente, um protocolo descrevendo o lonimagiologia g prazo de cérebros larvais intactas na presença de ácido ascórbico, o soro, e corpos gordos foi detalhado ^29. Importante, porque o tecido é exposto nem nem imobilizados, esta abordagem é menos útil para aplicações onde o meio de cultura é trocado (por exemplo, estudos de drogas, imunodepleção, etc.).

Nosso laboratório simplificou toda a preparação monte de cérebros de larvas vivas para imagens de longo prazo ^{30, 31.} A principal vantagem para o nosso protocolo sobre os outros é a sua simplicidade: as nossas observações indicam nem soro, ácido ascórbico, a insulina, nem corpos gordos são aditivos necessários à Imagem sucessivas rondas de NB ACD. Apesar de aditivos, tais como insulina, têm sido úteis para a imagem prolongado de divisões de células-tronco ³² e migração celular colectivo em Drosophila ovários ^33, eles parecem ser dispensável para NB ACD, como nosso meio de imagem consiste de uma mistura simples de standard meio de cultura de células de inseto suplementado com antibiótico-antimicótico para evitar a contaminação. Através do uso de placas de cultura de fundo gás-permeáveis ​​ou de vidro reutilizáveis, temos sido capazes de sustentar várias rodadas de sucessivas NB DACs. As mesmas amostras de explante pode ser prontamente utilizado para imunofluorescência e outros procedimentos com tecido fixado. Neste protocolo, detalhamos a dissecação de cérebros de larvas intactas, bem como a preparação de cérebros para a análise tanto ao vivo e fixo.

Protocol

1. Preparação de materiais necessários para Explante Brains terceiro instar larval Preparar as ferramentas necessárias para a microdissecção. Forjar duas ferramentas de dissecação (um bisturi e um gancho), colocando primeiro um único pino de dissecação em cada titular pino. Prenda os pinos firmemente com a mão ou com um alicate (Figura 1C). Use um par de pinças de idade para dobrar um pino de dissecação de um ângulo de aproximadamente 120 °. Faça isso sob …

Representative Results

Imagens ao vivo elucidou uma série de mecanismos que regulam NB ACD. Antes da aquisição da imagem, é necessário determinar as condições de imagem ideal. É necessário equilibrar a taxa de captura de quadro com a duração de imagens de células vivas. Para a análise celular fina, por exemplo, o aumento temporal e resolução óptica pode ser necessária. Ao visualizar um único ciclo celular NB (Figura 4A), a taxa na qual as imagens são captadas pode ser aumentada, sem a introdução de fotoen…

Discussion

Imagens de células vivas é uma abordagem valiosa usada para estudar os mecanismos que regulam a ACD de células-tronco, a diferenciação de linhagens celulares, ea morfogênese de tecidos complexos. Embora os grupos de pesquisa têm historicamente utilizada uma variedade de técnicas para visualizar NB ACD, estas abordagens podem ser geralmente agrupadas em duas categorias que diferem principalmente no que diz respeito ao facto de o tecido cerebral é deixada intacta ou dissociada.

Imagem…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.