Live avbildning av<em> Drosophila</em> Larvneuroblaster

Summary

Detta protokoll detaljer en strömlinjeformad metod som används för att utföra levande cell imaging i samband med en intakt larver hjärna. Levande cell imaging metoder är ovärderlig för studier av asymmetriska neurala stamcells divisioner samt andra neurogena och utvecklingsprocesser, konsekvent avslöja mekanismer som tidigare förbisetts.

Abstract

Stamceller delar asymmetriskt för att generera två avkomma celler med olika öde potential: en självförnyande stamceller och ett differentierande celler. Med tanke på deras betydelse för utveckling och sjukdom, att förstå de mekanismer som styr asymmetriska stamcells division har en robust område av studien. Eftersom de är genetiskt lätthanterlig och genomgår successiva celldelning ungefär en gång i timmen, stamcellerna i Drosophila centrala nervsystemet, eller neuroblaster, är oumbärliga modeller för studier av stamceller division. Om 100 neurala stamceller är placerade nära ytan av vardera av de två larvhjärnlober, vilket gör detta modellsystem särskilt användbara för levande avbildning mikroskopiska studier. I detta arbete, granskar vi flera metoder som ofta används för att visualisera stamcells divisioner, och vi itu med de relativa fördelarna och nackdelarna med de tekniker som anställer dissocieras kontra intakta hjärnvävnader. Vi också detalj vår simplifIED protokoll som används för att explantera hela hjärnor från tredje stadiet larver för levande cell imaging och fasta applikationer analys.

Introduction

Stamceller upprätthålla en balans av differentiering och självförnyelse för att generera cellulära mångfald under tidig utveckling och ersätta skadade celler i vuxna vävnader. Reglering av denna homeostas bygger både förlust och överexpansion av stamceller befolkningen, vilket kan leda till skadlig vävnadsdegeneration eller tumörbildning.

Neuroblaster (NBS) är de i stor utsträckning studerats neurala stamceller av Drosophila centrala nervsystemet (Figur 1A) som första formen under embryonala stadier ^{1, 2.} NBs genomgå upprepade omgångar av asymmetrisk celldelning (ACD) för att producera två ojämnt ödesbestämda celler: en självförnyande stamceller och ett differentierande celler. ACD styrs av centrosomes, icke-membranorganeller som fungerar som de mikrotubuli-organiseringscentrum flesta celler ^3. Under mitos, NB centrosomes organisera och orientera den bipolära mitotiska spindeln längs apikal-basala polartetsaxeln. Vid klyvning av dela NB, apikala öde bestämningsfaktorer som anger stamceller öde, och basala öde bestämningsfaktorer som anger differentiering, är uppdelade i de ojämlika dottercellerna.

I larver centrala hjärnan, kan två typer av NBs särskiljas genom sitt antal, placering, transkriptionsfaktor uttryck, och cellinje (Figur 1A) ^4-6. Typ I NBs är de mest förekommande och cirka 90 av dem befolka de främre och bakre sidorna av varje optik loben av hjärnan ^7. Dessa NBs uttrycker transkriptionsfaktor aSENSE (ASE), och de karakteristiskt dela in i en självförnyande NB och en mindre ganglion modercellen (GMC, Figur 1B). Varje GMC genomgår en enda terminal division för att generera två nervceller eller glia (Figur 1B). Däremot har de åtta typ II NBs som befolkar den bakre sidan av varje optisk lob saknar Ase uttryck ^5. De genomgår ACDatt tillverka en själv förnya NB och en mellanliggande neurala progenitorceller (INP).

Den INP i sin tur delar asymmetriskt tre till fem gånger. Var och en av dessa divisioner leder till regenerering av INP och produktionen av ett enda GMC ^4. Kollektivt ger de specifika NB identitet och den tidsmässiga ordningen GMC födelse upphov till den häpnadsväckande neuronal mångfald av den vuxna centrala nervsystemet.

Förstå cellbiologi som ligger bakom NB ACD har kraftigt förbättrats genom användning av levande cellavbildningstekniker. Publicerade protokoll som används av forskare till bild levande NBs varierar kraftigt. Totalt sett är dock dessa metoder kan delas in i två allmänna kategorier kännetecknas av huruvida larv hjärnan lämnas intakt eller mekaniskt dissocierade. Båda teknikerna har olika fördelar och nackdelar beroende på forskarens ansökan.

Tidiga rapporter avslöjar levande NB celler diviserna inbegriper en viss grad av manuell dissociation av larv hjärnan. Dessa protokoll detalj smetar ⁸ eller retas isär ⁹ hjärnan för att växa kortsiktiga primära kulturer av NBS på täckglas. För att förbättra avbildning, är de runda NBs vanligen tillplattad på täckglas med antingen glasskivor ⁸ eller agaros kuddar ^9. Även om tillplattade celler har förbättrad optik, är dessa tekniker ofta leda till NB mitotiska defekter, inklusive regression av klyvnings fåra och oförmågan att fördela mer än en gång. Därför är protokoll som innebär både manuell dissociation och fysisk snedvridning av larver hjärnvävnad i allmänhet endast lämpar sig för mycket kortfristiga (dvs., En cellcykel eller mindre) tillämpningar. Likaså semi-squash eller helt plattas intakta hjärnor mellan objektglas och täck begränsar den tid man kan spendera avbildning ett givet exemplar till en ca 30 min period ^10. Trots denna begränsning, this tillvägagångssätt har använts med framgång ^11-14.

Nya insatser för bild levande dissocierade NBs gräns fysisk snedvridning av de isolerade cellerna. Dessa tekniker är särskilt användbara för applikationer där det är nödvändigt för att upprätthålla cellkulturer för flera celldelningscykler. Exempelvis kan dispergerade celler från manuellt dissocierade hjärnor vara delvis inbäddade i en propp framställd av en blandning av fibrinogen och trombin ¹⁵ för långvarig avbildning ^16. Alternativt kan explanterade hjärnor vara första kemiskt dissocierade med enzymet kollagenas, nästa manuellt sönder genom upprepad passage genom en pipettspets och därefter ströks ut på poly-L-lysin-belagda glas botten rätter ^{17, 18.} Beläggning glas rätter med antingen fibrinogen eller poly-L-lysin främjar kvarstad och liten spridning av runda celler, föra dem så nära täckglaset som möjligt utan stora fysiska distorsion. I additiom dessa metoder innebär odling NBS i medium som lätt kan bytas ut mot farmakologiska störningsförsök ^18. Sammantaget direkt plätering spridda NBs förbättrar avbildningsoptik utan att offra långsiktiga bildhanteringsfunktioner. Nyligen har ett protokoll som beskriver den långsiktiga odling av dissocierade NBs blivit närmare ^19.

Emellertid är detta tillvägagångssätt inte utan begränsningar. Det finns flera varningar för avbildning levande dissocierade NBs. I ett fält av spridda celler, till exempel, är det svårt att identifiera specifika NB härstamningar som rumsligt är organiserade i den intakta hjärnan ^1. Likaså skilja typ I kontra typ II NBs inom dissocierade vävnaden är också en utmaning utan ett uttryck för härstamning spårämnen eller subtyp-specifika transgener, såsom worniu-GAL4, aSENSE-GAL80 ^20. Även om dessa transgener är ganska bra för vissa tillämpningar, de begränsar forskare till dem transgener expressas under kontroll av UAS förstärkarelement ²¹ och kräver mer komplexa genetiska system. Studier som rör rumslig eller tidsmässig utveckling av NBs därför kräva in vivo imaging i samband med en intakt vävnad.

Vidare studier av dissocierade embryonala NBs indikera att den fysiska kontakten mellan angränsande celler är kritisk för interfas lokalisering av nyckel polaritet faktorer ^{22, 23.} Dessa studier visar helt isolerade NBs upprätthålla inte längre den invarianta mitotiska spindelaxeln. Istället visar dessa celler en mer randomiserade spindelaxeln och breda vinklar av separation mellan successiva GMC knoppar, kanske på grund av förlusten av apikala centro placering ^22. Även förhållandet mellan larv NBs och deras angränsande celler inte har studerats, är det värt att överväga att larvstamcellsmikromiljö kan träffa cellpolaritet eller annanbeteenden. För att bibehålla den fysiologiska sammanhang larver NBs, vi bild ACD från hela hjärnor.

Med tanke på de begränsningar i samband med bildbehandling dissocierade NBs, har vårt labb och andra etablerade protokoll för bild successiva NB ACD från hela larver hjärnor. Teknik för bild intakta hjärnor ersätta ofta den stela ytan av glaset på ena sidan av odlingskammare med ett flexibelt membran för att förhindra vävnad distorsion eller skada och medger gasutbyte. Vissa metoder innefattar montering explanterade hjärnor i en blandning av insektsodlingsmedium, serum och askorbinsyra med fett kroppar som isolerats från tio larver ^24. De isolerade fett organ läggs till, eftersom de utsöndrar en mitogen känd för att stimulera NB celldelning ^25. Detta protokoll bevarar integriteten av vävnaden i över 3 timmar och är därför mottaglig för långsiktig avbildning ^{24, 26-28.} Nyligen, ett protokoll som beskriver long sikt avbildning av intakta larv hjärnor i närvaro av askorbinsyra, serum och fett organ har närmare ^29. Viktigt, eftersom vävnaden är varken utsatt eller immobiliserade, är detta tillvägagångssätt är mindre användbart för applikationer där odlingsmediet är utbytta (t.ex. läkemedelsstudier, immunotömning osv.).

Vårt labb har förenklat hela berget beredningen av levande larver hjärnor för långsiktig avbildning ^{30, 31.} Den största fördelen med våra protokoll över andra är dess enkelhet: våra observationer indikerar varken serum, askorbinsyra, insulin, eller fett organ är nödvändiga tillsatser till bild successiva rundor av NB ACD. Även tillsatser, såsom insulin, har varit till nytta för långvarig avbildning av stamceller divisioner ³² och kollektiv cell migration i Drosophila äggstockarna ^33, de verkar vara umbärliga för NB ACD, som vår bildalstringsmedium består av en enkel blandning av standard insektscellodlingsmedium kompletterat med antibiotisk-antimykotisk att förhindra förorening. Genom att använda återanvändningsbara gas-permeabla eller glas botten kultur rätter, har vi kunnat upprätthålla flera omgångar av varandra NB ACDs. Samma explanterade prov kan lätt användas för immunofluorescens och andra förfaranden med fast vävnad. I detta protokoll, vi detalj dissektion av intakta larv hjärnor, liksom beredningen av hjärnor för både live och fast analys.

Protocol

1. Beredning av Material som behövs till explantation Tredje Instar Larvernas hjärnor Förbered verktyg som krävs för microdissection. Forge två dissekera verktyg (en skalpell och en krok) genom att först placera ett enda dissekera stift i varje stift hållaren. Säkra stiften tätt för hand eller med en tång (Figur 1C). Använd ett par gamla tång för att böja en dissekera stift till en cirka 120 ° vinkel. Gör detta under ett dissektionsmikroskop för att se ti…

Representative Results

Live avbildning har belyst ett antal mekanismer som reglerar NB ACD. Före bild förvärv, är det nödvändigt att bestämma de optimala avbildningsförhållanden. Det är nödvändigt att balansera ram fånga takt med längden på levande cell imaging. För fina cellulär analys, till exempel ökad tids och optisk upplösning kan krävas. När visualisera ett enda NB cellcykeln (Figur 4A), kan den takt som bilderna tas ökas utan att införa fotoskador. Vanligtvis kan enstaka celldelningshändelser ö…

Discussion

Levande cell imaging är en ovärderlig metod för att studera de mekanismer som reglerar ACD av stamceller, differentiering av cellinjer, och morfogenes av komplexa vävnader. Även forskargrupper har historiskt sett används en mängd olika tekniker för att visualisera NB ACD, kan dessa metoder vara generellt delas in i två kategorier som främst skiljer sig åt med avseende på om hjärnvävnaden lämnas intakt eller dissocierade.

Imaging dissocierade NBs har sina fördelar. För en, di…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.