Canlı Görüntüleme<em> Drosophila</em> Larva nöroblastomun
Summary
Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.
Abstract
Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Kök hücreler, eşitsiz kader potansiyelli iki döl hücreleri üretmek için asimetrik bölün. Asimetrik kök hücre bölünmesi çalışmanın sağlam bir alan olmuştur yöneten mekanizmaların anlaşılması, geliştirilmesi ve hastalık onların alaka önüne alındığında. Bunlar genetik uysal ve bir kez, her saat hücre bölünmesinin ardışık mermi geçmesi için, Drosophila merkezi sinir sistemi veya neuroblasts kök hücreler, kök hücre bölünme çalışma için vazgeçilmez modellerdir. Yaklaşık 100 nöral kök hücre canlı görüntüleme çalışmaları için mikroskopi Bu model sistemi, özellikle faydalı bir hale getirir, her iki larva beyin lob her yüzeyine yakın olarak yerleştirilir. Bu çalışmada, yaygın kök hücre bölünmeleri görselleştirmek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar gözden ve biz göreceli avantaj ve bozulmamış beyin dokularında karşı ayrışmış çalıştırırız bu tekniklerin dezavantajlarını ele. Biz de detay bizim simplified protokol canlı hücre görüntüleme için Üçüncü dönem larva ve sabit analiz uygulamaları bütün beyinleri eksplantasyona için kullanılır.
Introduction
Kök hücreleri erken gelişim sırasında hücresel çeşitlilik oluşturmak ve yetişkin dokularda hasar gören hücrelerin yerine bir farklılaşma denge ve kendini yenileme korumak. Bu homeostazının düzenlenmesi kaybı ve zararlı doku dejenerasyonu ya da tümör oluşumu ile sonuçlanabilir kök hücre popülasyonunun aşırı genişlemesini hem de önler.
Nöroblastomun (Onaylanmış) Drosophila merkezi sinir sistemi (Şekil 1A) embriyonik aşamalarında 1, 2 sırasında o ilk formu çok çalışılan nöral kök hücrelerdir. Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Onaylanmış iki eşitsiz kaderde hücreleri üretmek için asimetrik hücre bölünmesi (ACD) tekrarlanan mermi tabi. ACD sentrozom, çoğu hücre 3'ün mikrotübül organizasyon merkezi olarak hareket olmayan zar organeller tarafından yönlendirilmektedir. Mitoz sırasında NB centrosomes düzenlemek ve apikal-bazal polar boyunca bipolar mitotik iğ yönlendirmekSığ ekseni. Bölünmesi NB ayrılması üzerine, kök hücre kaderini belirlemek apikal kader belirleyici ve farklılaşma belirtmek bazal kader belirleyici, eşitsiz kızı hücrelere ayrılmış olan.
Larva orta beyinde, Onaylanmış iki tür bunların sayısı, konumu, transkripsiyon faktörü ifadesi ve hücre soyu (Şekil 1A) 4-6 ile ayırt edilebilir. I Onaylanmış en bol olan yazın ve yaklaşık 90 tanesi beyin 7 her optik lob ön ve arka tarafı doldurmak. Bu Onaylanmış transkripsiyon faktörü asense (Ase) ifade ve karakteristik bir kendini yenileyen NB bölmek ve bir küçük ganglion anne hücre (GMC; Şekil 1B). Her GMC iki nöron veya glia (Şekil 1B) oluşturmak için tek bir terminal bölümü uğrar. Buna karşılık, her bir optik lobun arka tarafını doldurmak sekiz Tip II NBs Ase ifadesini 5. yoksundur. Onlar ACD geçmesibir kendini yenileyen NB ve bir ara nöral progenitör (INP) üretmek.
INP da, asimetrik 3-5 kez böler. InP rejenerasyonu ve tek GMC 4 üretiminde Bu bölümler bir sonuç her biri. Toplu olarak, özel NB kimliği ve GMC doğum zamansal sırası, yetişkin merkezi sinir sisteminin nöronal şaşırtıcı çeşitliliğine yol açar.
NB ACD temelini hücre biyolojisi çok canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiştir Anlamak. Görüntü canlı NB'ler için araştırmacılar tarafından kullanılan yayınlanan protokolleri yaygın olarak değişebilir. Genel olarak, bununla birlikte, bu yöntemler, larva beyin değişmeden kalır ya da mekanik olarak ayrışmış olup olmadığını ayırt iki genel kategoride toplanabilir. Her iki teknik araştırmacının uygulamaya bağlı olarak, farklı avantaj ve dezavantajları var.
Canlı NB hücre Divi ortaya Erken raporlarları larva beyin manuel ayrışma bir dereceye içerir. Bu protokoller detay 8 bulaşıyor ya da cam lamelleri Onaylanmış kısa vadeli birincil kültürleri büyümek için ayrı 9 beyin alay. Görüntüleme geliştirmek için, yuvarlak Onaylanmış genellikle cam slaytlar 8 veya agaroz pedleri 9 ile ya lamelleri üzerinde düzleştirilir. Düzleştirilmiş hücreler optik geliştirilmiş olmasına rağmen, bu teknikler çoğu zaman bölünme karık gerileme ve birden çok kez bölmek için yetersizlik de dahil olmak üzere, NB mitotik kusurlarına yol açar. Bu nedenle, manuel Ayrışma ve larva beyin dokusunun fiziksel bozulmasını hem içeren protokolleri genellikle sadece çok kısa vadeli (yani., Bir hücre döngü ya da daha az) uygulamaları için uygundur. Aynı şekilde, yarı silinmesine veya tamamen cam slaytlar ve lamelleri arasındaki sağlam beyinleri düzleştirme birinin bir, yaklaşık 30 dakikalık bir süre için 10, belirli bir örnek görüntüleme harcayabilir zamanını sınırlar. Bu sınırlama, thi rağmenyaklaşımı başarıyla 11-14 kullanılmaktadır.
Görüntü canlı için son çabalar NBs limiti izole hücrelerin fiziksel bozulma ayrışmış. Bu teknikler, birden fazla hücre bölünmesi devir için hücre kültürlerinin sürdürmek için gerekli olan uygulamalar için özellikle yararlıdır. Örneğin, el ile ayrışmış beyinlerinden alınmış dağılmış hücrelerden, kısmen uzun süreli görüntüleme 16 fibrinojen ve trombin 15 karışımından yapılan bir pıhtı gömülü olabilir. Seçenek olarak ise, eksplante beyin kimyasal olarak, enzim bir sonraki el ile bir pipet ucu ile tekrar geçirilerek kesintiye kolajenaz, ve daha sonra poli-L-lisin-kaplamalı cam alt yemekler 17, 18, kaplama ile ayrıştırılmış ilk olabilir. Fibrinojen ya da poli-L-lisin ya cam yemekleri Kaplama önemli fiziksel bozulma olmadan mümkün olduğu lamel onları yakın getirerek, yuvarlak hücrelerin yayılmasını eki ve hafif teşvik etmektedir. Additi yılında, bu yöntemler, hali hazırda pertürbasyon farmakolojik deneyler 18 için değiş tokuş edilebilir bir ortam içinde kültür edilmesini Onaylanmış içerir. Genel olarak, doğrudan kaplama NBs uzun vadeli görüntüleme yetenekleri ödün vermeden görüntüleme optik geliştirir dağıldılar. Son zamanlarda, ayrışmış Onaylanmış uzun vadeli kültürlemenin açıklayan bir protokol 19 ayrıntılı olmuştur.
Ancak, bu yaklaşım sınırlamaları olmadan değildir. Canlı ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için çeşitli uyarılar vardır. Dağılmış bir hücre alanında, örneğin, uzamsal olarak sağlam bir beyin 1 düzenlenmesiyle belirli NB soy tespit etmek zordur. Aynı şekilde, Tip II ayrışmış doku içinde Onaylanmış karşı Tip I ayırt örneğin worniu-GAL4, asense Gal80-20 gibi soy ajanları ya da alt tip spesifik transgenlerin, ekspresyonuna olmadan da zordur. Bu transgenler, bazı uygulamalar için oldukça yararlı olsa da, bu eski transgenler için araştırmacılar sınırı yokturUAS güçlendirici elemanın 21 kontrolünde preslenmiş ve daha karmaşık genetik düzenleri gerektirir. Onaylanmış mekansal ya da zamansal geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar, bu nedenle, bir sağlam doku bağlamında in vivo görüntüleme gerektirir.
Ayrıca, ayrışmış embriyonik Onaylanmış çalışmaları önemli polarite interfaz lokalizasyonu 22, 23, belirleyicilerinin için bitişik hücrelerin fiziksel temas kritik olduğunu gösterir. Bu çalışmalar tamamen izole NBs artık değişmez mitotik iğ ekseni korumak göstermektedir. Bunun yerine, bu hücreler nedeniyle belki de apikal centrosome konumlandırma 22 kaybı daha randomize mili ekseni ve ardışık GMC tomurcukları arasındaki ayrılık, geniş açıları gösterilecek. Larva NB'ler ve komşu hücreler arasındaki ilişki yaygın olarak incelenmiştir olmasına rağmen, bu larva kök hücre mikroçevresinin hücre polarite veya diğer değindiği olabileceğini dikkate değerdavranışları. Larva Onaylanmış fizyolojik içeriği muhafaza edilmesi için, tüm beyinlerinden biz görüntü ACD.
Görüntüleme ayrışmış NB'ler ile ilişkili doğal sınırlamalar dikkate alındığında, bizim laboratuvar ve diğerleri bütün larva beyinlerinden NB KHA görüntü ardışık tur protokolleri kurduk. Görüntü bozulmadan beyin teknikler genellikle doku bozulmasını veya zarar görmesini önlemek ve gaz değişimi için izin vermek için esnek bir membran ile kültür odasının bir tarafında cam sert yüzey değiştirin. Bazı yöntemler böcek kültür ortamı, serum ve on larva 24 izole edilmiş organlarla yağ, askorbik asit içeren bir karışım içerisinde eksplante beyinleri montaj içerir. Bu NB hücre bölünmesini teşvik 25 bilinen bir mitojen salgılayan için izole edilmiş yağ gövdeleri eklenir. Bu protokol üzerinde 3 saat için doku bütünlüğünü koruyan ve uzun süreli görüntüleme 24, 26-28 için uygun, bu nedenle,. Son zamanlarda, boylam açıklayan bir protokolaskorbik asit, serum ve yağ organlar mevcudiyetinde sağlam larva beyinlerin g İÇİ görüntüleme 29, ayrıntılı edilmiştir. Doku maruz ne de hareketsizleştirilir için önemlisi, bu yaklaşım kültürleme ortam değiştirilir uygulamalar için daha az faydalı olan (örneğin, vb, ilaç araştırmaları, imüno-,.).
Bizim laboratuvar uzun vadeli görüntüleme 30, 31 canlı larva beyinlerinin bütün montaj hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Başkaları üzerinde bizim protokolüne ana avantajı basitliği: bizim gözlemler NB KHA görüntü ardışık tur için gerekli katkı maddeleri ne serum, askorbik asit, insülin, ne de yağ organları gösterir. İnsülin gibi katkı maddeleri, kök hücre bölünmesi 32 ve Drosophila yumurtalık 33 toplu hücre göçü uzun görüntüleme için yararlı olmuştur, ancak eden görüntüleme ortamı sta basit bir karışımından oluşur, onlar, NB ACD için önemsiz görünmektedirndard böcek hücre kültürü ortamı bulaşmasını önlemek için antibiyotik-antimikotik ile takviye edilmiştir. Yeniden gaz-geçirgen veya cam alt kültür yemekleri kullanımı sayesinde, biz ardışık NB acds birkaç tur sürdürmek mümkün olmuştur. Aynı eksplante örnekler hali hazırda, bağışıklık ve sabit dokusu ile diğer işlemler için de kullanılabilir. Bu protokol, biz detay sağlam larva beyinlerinin diseksiyonu, yanı sıra canlı ve sabit hem de analiz için beyin hazırlanması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı hücre görüntüleme kök hücre ACD, hücre soylarının farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanılan çok değerli bir yaklaşım ve kompleks dokuların morfolojisi olan. Araştırma grupları tarihsel NB ACD görselleştirmek için çeşitli teknikler istihdam olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle öncelikle beyin dokusu bozulmadan sola veya ayrışmış olup olmadığını açısından farklılık iki kategoride toplanabilir.
Görüntüleme …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DAL ödüllendirildi Sağlık / enstitünün (1ZIAHL006126) ve bir Lenfant Biyomedikal Doktora Sonrası Araştırma Bursu National Institutes intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm | Sarstedt | 94.6077.410 | A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base. |
| Schneider's S2 Medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) | Invitrogen | 15240-062 | A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. |
| Glass coverslips, #1.5 22X22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | A high viscosity inert oil that is clear and colorless. |
| pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Minutien dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dissecting needle/probe with plastic handle | Fisher Scientific | 08-965-A | |
| Syringe filter, 0.22 mm pore size | Fisher Scientific | 09-719A | |
| Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | |
| plastic transfer pipet | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| paraformaldehyde, 32% EM-grade | Electron Microscopy Sciences | 15714 | CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling. |
| DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | A dye that labels DNA and is excited by UV light. |
| Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc. | Fisher Scientific | 18606-20 | A water-soluble mounting medium. |
References
- Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Biologie du développement. 125, 145-157 (1988).
- Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
- Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
- Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
- Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
- Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
- Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
- Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
- Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
- Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
- Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
- Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
- Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
- Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
- Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Biologie du développement. 319, 1-9 (2008).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
- Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
- Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
- Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
- Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
- Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
- Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
