高通量检测到的表型<em>沙门氏菌</em>伤寒协会，侵袭和复制的巨噬细胞
Summary
高通量测定法在体外表现型沙门氏菌或其他细菌的关联，侵袭和吞噬细胞与高通量能力的复制被开发。该方法来评估沙门氏菌基因敲除突变株的宿主-病原体相互作用的参与。
Abstract
沙门氏菌是人畜共患的病原体，并在人类和牲畜1食源性疾病的主要原因。了解潜在的沙门氏菌 -host相互作用的机制是很重要的澄清沙门氏菌感染的分子发病机制。在庆大霉素保护测定表型沙门氏菌协会，侵袭和复制在吞噬细胞被适配为允许高通量筛选中使用的RAW 264.7鼠巨噬细胞宿主的相互作用限定的沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌的缺失突变体的作用，在这种协议中，方差在测量相对于标准协议显著降低，因为野生型和多种突变株所用的相同的培养皿中，并在同一时间进行测试。使用多道移液器的增加的吞吐量并提高精度。此外，关注与使用较少豪每孔ST细胞在96孔培养皿中分别处理。在此，修改后的体外沙门氏菌侵袭使用吞噬细胞检测的协议被成功地应用到表型38个人沙门氏菌缺失突变体的关联，入侵和细胞内复制。 在体外表现型呈现，其中一些随后被证实具有体内表型的动物模型。因此，修饰的，标准化的检测，以表型沙门氏菌协会，侵袭和复制中的巨噬细胞与高通量的能力，可以利用更广义地来研究细菌-宿主相互作用。
Introduction
非伤寒沙门氏菌是所有脊椎动物肠道疾病的重要原因。沙门氏菌在人类是顶级的细菌经由食物传染的疾病，1间。该支撑沙门氏菌的互动与他们的动物宿主的分子机制的表征是通过沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌（STM）在感染的组织培养和动物模型的研究，主要实现的。争取在STM-宿主相互作用的见解将帮助我们了解沙门氏菌如何生存和发展的宿主细胞内。在研究这些相互作用的第一个挑战是要找出尽可能多的参与因素可能来自宿主与病原体，但这些努力在很大程度上阻碍了两个独立的复杂生物系统同时处理， 即主机和沙门氏菌的显著困难， 在生理条件下。此外，大repert沙门氏菌 oire和宿主基因可能编码参与宿主相互作用的因素需要高通量生物平台来解决这个难题。
一种改进的，标准化的检测表型沙门氏菌的关联，入侵和复制的巨噬细胞具有高吞吐能力的开发，研究大组基因可能参与沙门氏菌 -host互动。庆大霉素保护法于1973年2开发的，但第一次彻底Elsinghorst在1994年3,4描述。如今，它已成为研究细胞内的许多细菌病原体在体外 ，包括沙门氏菌 5,6的标准工具。内在的细菌避免被打死一些抗生素，如庆大霉素，无法穿透真核细胞3。通过利用这种现象的优点，该庆大霉素保护法测量细胞内巴的存活和生长cterial病原体。在感染过程中三个事件， 即与真核细胞浸润和复制相关联，可以评价为基于感染，庆大霉素处理，并进一步温育（ 图1）之间的时间间隔内的细菌病原体。真核细胞系提供了生理环境比相关的动物模型宿主 – 病原体相互作用的研究那么复杂。
在庆大霉素保护测定是适当的平台来研究STM-宿主的相互作用，但在24孔培养皿中的标准测定具有低吞吐量。 体内数据集的计算分析确定的被预测到大约300宿主基因产物（未发表数据）进行交互149 沙门氏菌基因产物。标准庆大霉素保护测定不具有有效地表现型的突变体的这一数量的能力。
在乳房清洁度离子，庆大霉素保护法理论上可以检测到入侵，甚至一个单一的细菌。因为这个固有的敏感性，当在不同时间重复的原始数据是容易的技术差异。内部控制及标准化后的相对数据呈现对于结果的有意义的解释是必不可少的。鉴于这些考虑，改良，标准化庆大霉素保护法的开发，以提高检测能力，提高精确度。
下面的协议是详尽和图示来执行使用96孔培养皿中，并在小鼠巨噬细胞的RAW264.7细胞系的改性庆大霉素保护测定。相比于在24孔培养皿中的标准协议，修改后的协议具有以下优点：1）使用96孔培养皿允许多达10个不同的突变体菌株进行表型，包括以足够的统计功率内部阳性对照和阴性对照;2）结果的方差显著降低，因为该突变株在相同的培养皿中，并在同一时间进行测试; 3）采用多道移液器的增加吞吐量，同时减少操作员的疲劳。最后，比较于24孔培养皿中，每孔少的宿主细胞在96孔培养皿中的关注通过协议优化和标准化得到解决。
在摘要中，改性的，标准化的检测，以在体外表现型沙门氏菌或其他细菌的关联，侵袭和复制在吞噬细胞中增加精度，并实现高通量的能力，同时降低了操作者的疲劳。
Protocol
Representative Results
Discussion
在庆大霉素保护法被广泛地用于研究的侵袭宿主细胞内的细胞内细菌病原体和复制，并且它是特别重要的生物学工具用于研究的病原体，如沙门氏菌 ，其侵袭是用于建立感染1的前提步骤。 沙门氏菌研究界的标准庆大霉素保护法在24孔培养皿5来实现。虽然使用48或者甚至96孔板中之前讨论的用于高通量能力9，没有实际的协议已被证明在细节和成功地用于测试?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目由赠款卫生NIAID（用于AJB和LGA，R01 AI076246）全国学院部分支持。 沙门氏菌突变收集部分被卫生补助国立研究院（对于MM们，U01 A152237-05，R01 AI07397-01，R01 AI039557-11和R01 AI075093-01），部分原因是对健康补助国立研究院（HAP的，R21支持AI083964-01，1R0 1AI083646-01，1R56AI077645，R01 AI075093）。我们感谢斯特芬Prowollik的副本电镀和确认集合中的突变体。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100X Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
- Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
- Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
- Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
- Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
- Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
- Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
- Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
- Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
- Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
- Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).
