حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات
Summary
Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Abstract
التصاق خلية خلية هو الأساسي في الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من بروتينات سطح الخلية. ومع ذلك، يتم مفهومة التفاعلات لاصقة لكثير من هذه البروتينات. هنا نقدم طريقة بسيطة وسريعة لوصف خصائص لاصقة من المفترضة مقتصر على المطابق جزيئات التصاق الخلية. و transfected خلايا HEK293 مثقف مع بلازميد الحمض النووي ترميز يفرز،، حاتمة الموسومة ectodomain من بروتين سطح الخلية. باستخدام الخرز بين functionalized محددة للعلامة حاتمة، يتم التقاط القابلة للذوبان، انصهار بروتين يفرز من مستنبت. ويمكن بعد ذلك حبات المغلفة استخدامها مباشرة في حبة المقايسات التجميع أو في حبة الفلورسنت فرز فحوصات لاختبار التصاق مقتصر على المطابق. إذا رغبت، الطفرات يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتوضيح الأحماض الأمينية المحددة أو المجالات المطلوبة للالتصاق. هذا الاختبار يتطلب سوى كميات صغيرة من البروتين المعبر عنها، لا يتطلب إنتاج خطوط الخلايا مستقرة، ويمكن عكاmplished في 4 أيام.
Introduction
التصاق خلية خلية ضروري لتطوير وسلامة الكائنات متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة متنوعة من جزيئات سطح الخلية. وقد تم تحديد العديد من هذه جزيئات الالتصاق ويتميز، رغم أن الكثيرين لا يزال يتعين اكتشافها. وتستخدم عدة طرق لتحقيق خصائص خلية التصاق جزيئات (الحدب)، بما في ذلك الخلايا فرز فحوصات، فحوصات تجميع خلية 1-8 والأساليب الفيزيائية الحيوية، مثل مجهر القوة الذرية والسطحية قوة التحليل الطيفي 9-12.
تعقيد حتى مبسطة في أنظمة المختبر باستخدام خطوط الخلايا يجعل من الصعب تحديد خصائص لاصقة من المفترض CAM. عادة، يعتبر جزيء وCAM إذا كان يدفع تجميع الخلايا عندما transfected في خط خلية غير لاصقة. ومع ذلك، فمن الواضح أن هذا ليس دليل مباشر على النشاط اصقة. على سبيل المثال، وتسهيل إيصال سطح الخلية أو استقرارسوف CAM يؤدي أيضا إلى زيادة تجميع خلية 1،13. وعلاوة على ذلك، قد تفشل CAM صحيح للتوسط تجميع خلية إذا كان خط الخلية تفتقر العوامل المشتركة الأخرى المطلوبة للتسليم سطح الخلية أو الاستقرار.
لتجنب هذه العوامل المعقدة، والمزيد من المقايسات المباشرة يمكن استخدامها التي تستند على فكرة أن التفاعلات لاصقة يجب أن تكون خاصية البيوكيميائية الجوهرية المجال خارج الخلية. بينما الخرز المستخدمة في البداية لوصف NG-CAM 2، وقد تم تمديد هذه المقايسات من أجل التحقيق بوساطة كادهيرين التصاق 12،14،15. باستخدام الانصهار من C-كادهيرين اندماج ectodomain-FC، أظهر مختبر Gumbiner أن يكرر كادهيرين متعددة تساهم في التفاعلات مقتصر على المطابق 14. عن طريق مقارنة المقايسات حبة التجميع، E-كادهيرين وN-كادهيرين التصاق كما تم يتميز 12،15، وكذلك عدد من protocadherins 1،15-18 والإسوية Dscam من ذبابة الفاكهة <em> 19. نحن هنا وصف مقايسة بسيطة نسبيا وسريع لوصف النشاط لاصقة من يفرز، ectodomains الموسومة حاتمة من الحدب مقتصر على المطابق المفترضة (الشكل 1). وقد استخدمنا هذا الاختبار في المقام الأول إلى تميز أعضاء الفصيلة كادهيرين.
Protocol
Representative Results
Discussion
التصاق الخلية هو سمة أساسية من سمات الحياة متعددة الخلايا وبوساطة مجموعة واسعة من بروتينات سطح الخلية. من هذه، وفهم الخصائص التفصيلية لاصقة سوى نسبة صغيرة نسبيا. هنا، التي وصفناها بروتوكول بسيطة وسريعة للتحقيق في قدرة لاصقة مقتصر على المطابق من ectodomains يفرز تنصهر علا…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
| pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
| HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
| DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
| 100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
| Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
| Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
| Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
| Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
| 0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
| Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
| Table of Buffers/Solutions | ||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neurosciences. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neurosciences. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
