Perle aggregering Analyser for karakterisering av Antatte celleadhesjonsmolekyler

Summary

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Abstract

Celle-celle adhesjon er grunnleggende for flercellet liv og formidles av et variert utvalg av celleoverflateproteiner. Imidlertid er de adhesive interaksjoner for mange av disse proteiner dårlig forstått. Her presenterer vi en enkel, rask metode for å karakterisere klebende egenskaper antatte homofilist celleadhesjonsmolekyler. Dyrkede HEK293-celler transfektert med plasmid DNA som koder for et utskilt, epitop-tagget ektodomenet av et celleoverflateprotein. Ved hjelp av funksjon perler spesifikke for epitop tag, er løselig, utskilt fusjonsprotein tatt fra kulturmediet. De belagte perler kan så brukes direkte i bead aggregering assays eller fluorescerende vulsten sortering assays for å teste for homofilist adhesjon. Hvis ønskelig, kan mutagenese deretter benyttes for å belyse de spesifikke aminosyrer eller domener som kreves for adhesjon. Denne assay krever bare små mengder av uttrykt protein, ikke krever produksjon av stabile cellelinjer, og kan ACCOmplished i 4 dager.

Introduction

Celle-celle adhesjon er avgjørende for utvikling og integriteten til flercellede organismer, og er formidlet av et variert utvalg av celleoverflatemolekyler. Mange av disse adhesjonsmolekyler har blitt identifisert og karakterisert, men mange gjenstår å bli oppdaget. Flere metoder blir brukt for å undersøke egenskapene for celleadhesjonsmolekyler (kammene), inkludert cellesorteringsanalyser, celle aggregering assays ^1-8 og biofysiske metoder, slik som atomic force microscopy og overflatekraft-spektroskopi ^9-12.

Kompleksiteten selv forenklet in vitro systemer ved hjelp av cellelinjer gjør det vanskelig å fastslå klebende egenskaper en antatt CAM. Typisk blir et molekyl betraktet som en CAM celle dersom den induserer aggregering når transfektert inn i en ikke-klebende cellelinje. Imidlertid er det klart at dette ikke er direkte bevis for klebe aktivitet. For eksempel, å lette celleoverflaten levering eller stabiliteten i enCAM vil også føre til økt celle aggregering ^1,13. Videre kan en sann CAM mislykkes i å mediere celle aggregering hvis cellelinjen mangler andre ko-faktorer som er nødvendige for celleoverflaten eller stabilisering levering.

For å unngå disse kompliserende faktorer, mer direkte analyser kan anvendes som er basert på ideen om at adhesive interaksjoner bør være en iboende egenskap ved biokjemisk det ekstracellulære domene. Mens perler ble opprinnelig brukt til å karakterisere Ng-CAM ^2, har disse analysene blitt utvidet for å undersøke cadherin-mediert vedheft ^12,14,15. Ved hjelp av fusjon av C-cadherin ektodomenet-Fc fusjoner, den Gumbiner lab viste at flere cadherin gjentar bidra til homofilist interaksjoner ^14. Ved hjelp av sammenlignbare perle aggregering analyser, E-cadherin og N-cadherin vedheft har også vært preget ^12,15, som har en rekke protocadherins ^1,15-18 og Dscam isoformer fra Drosophila <em> ^19. Her beskriver vi en relativt enkel og hurtig assay for å karakterisere den klebende aktiviteten av utskilte, epitop-tagget ectodomains av putative homofilist CAM (figur 1). Vi har brukt dette assay primært for å karakterisere medlemmer av superfamilien cadherin.

Protocol

1. Cell Forberedelse (Dag -2 til 0) Split HEK293-celler 1: 5 ved bruk av 0,05% Trypsin-EDTA-løsning og inkuberes i vekstmedier ved 37 ° C med 5% CO2 inntil 60 – 80% sammenflytende (2-3 dager). For hver tilstand, dyrke celler i 2 x 100 mm skåler. 2. Cell Transfeksjon (Dag 1) Transfektere HEK293-celler med plasmid som koder Fc-fusjon med en transfeksjon reagens slik som Lipofectamine. Alternative fremgangsmåter som resulterer i sammenlign transfeksjon…

Representative Results

Et eksempel eksperimentet er presentert i figur 2, som viser kalsium-avhengige aggregering av vulsten ektodomenet av N-cadherin fusjonert til Fc (NcadEC-Fc). I fravær av kalsium, perler oppviser liten eller ingen tendens til å aggregere, og det ikke er noen økning i samlet størrelse med tiden (figur 1A, C). I nærvær av kalsium, perler belagt med NcadEC-Fc-show robust aggregering, med samlet størrelse øker over tid (figur 1B, C). Dette eksperimentet ble gje…

Discussion

Celle adhesjon er en viktig funksjon av flercellet liv og formidles av et bredt spekter av celleoverflateproteiner. Av disse er de detaljerte klebeegenskaper forstås for bare en forholdsvis liten andel. Her har vi beskrevet en enkel, rask protokoll for å undersøke homofilist limet kapasitet skilles ectodomains smeltet til en praktisk epitope tag. Denne tilnærmingen har en rekke viktige fordeler. For det første er stabile cellelinjer ikke nødvendig ^14,20, som tilstrekkelige mengder av protein kan bli gen…

Materials

Name of Material/ Equipment	Catalog Number	Company
pFc-N1 plasmid	To be submitted	Addgene
HEK293 cells	CRL-1573	American Type Culture Collection
DMEM	10-013-CV	Mediatech – Corning
Fetal Bovine Serum (FBS)	F2442	Sigma
100X Pen-Strep (10,000 U/ml)	15140-122	Life Technologies
0.05% Trypsin-EDTA	25300054	Life Technologies
Lipofectamine 2000	11668030	Life Technologies
Dynabeads – Protein G	10003D	Life Technologies
Bovine Serum Albumin	A3294	Sigma
Depression slides	71878-06	Electron Microscopy Sciences
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	UFC901024	Millipore
0.45mm syringe filter	83.1826	Sarstedt
Dynamag-2 Magnet	12321D	Life Technologies
Fiji (ImageJ) Image Analysis Software		http://fiji.sc/Fiji
Table of Buffers/Solutions
Growth Media	DMEM + 10% FBS + Pen-Strep	Filter sterilize and store at 4°C.
Growth Media – FBS	DMEM + Pen-Strep	Filter sterilize and store at 4°C.
Binding Buffer	50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA	Vortex until dissolved, keep on ice.