Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller
Summary
Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Abstract
Hücre-hücre yapışması çok-hücreli yaşam için esas olduğunu ve hücre yüzeyi proteinlerinin çeşitli bir dizi aracılık eder. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu için yapışma etkileşimlerini tam olarak anlaşılamamıştır. Burada farazi homofilik hücre yapışma moleküllerinin yapışkanlık özelliklerini karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntem sunuyoruz. Kültürlenmiş HEK293 hücreleri DNA plazmid, bir hücre yüzeyi proteini, salgılanan, epitop takılı ekto sahası kodlayan yapılarla transfekte edilir. Epitop takısı için spesifik işlevselleştirilmiş boncuk kullanılarak, çözünür, salgılanan füzyon proteini kültür ortamından tespit edilir. Kaplı boncuklar, homofilik yapışma test etmek üzere deneyler sıralama boncuk agregasyonu deneylerinde ya da floresan boncuğu direkt olarak kullanılabilir. Eğer arzu edilirse, o zaman mutagenez yapışması için gerekli olan özel amino asitleri ya da etki aydınlatmak için kullanılabilir. Bu deney, stabil hücre hatlarının üretilmesini gerektirmez, ifade edilen proteinin sadece küçük miktarlarda gerektirir ve acco edilebilir4 gün içinde mplished.
Introduction
Hücre-hücre yapışma çok hücreli organizmaların gelişimi ve bütünlüğü için gerekli olan ve hücre yüzeyi zengin bir molekül dizisi aracılık eder. Birçok tespit edilmesi gerekmektedir, bu da yapışma moleküllerinin çoğu, tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Çeşitli yöntemler, atomik kuvvet mikroskopisi ve yüzey kuvvet spektroskopisi 9-12 gibi hücre sıralama deneyleri, hücre toplama deneyleri 1-8 ve biyofiziksel yöntemler dahil olmak üzere, hücre yapışma moleküllerinin özellikleri (CAMlar) araştırmak için kullanılır.
Da hücre dizileri kullanılarak in vitro sistemlerde basitleştirilmiş karmaşıklığı zor bir varsayımsal CAM yapışkanlık özelliklerini belirlemek için yapar. Tipik olarak, bir molekül, bir yapışkan olmayan hücre hattı içine geçirildiğinde, hücre birikmesinin sebep olursa CAM olarak kabul edilir. Ancak, bu yapışkan etkinliğinin doğrudan bir kanıt olmadığı açıktır. Örneğin, bir hücre yüzeyi dengesini ve çıkışını kolaylaştırmakTAT aynı zamanda, artmış hücre toplanmasının 1,13 ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, gerçek bir TAT hücre çizgisi, hücre yüzeyi gönderilmesi veya stabilizasyonu için gerekli diğer ko-faktörlerini sahip olmayan hücre toplanmasını aracılık başarısız olabilir.
Bu komplike faktörleri önlemek için, fikrine dayanır daha doğrudan tahlilleri kullanılabilecektir yapışma etkileşimlerini hücre dışı bir alanındaki bir içsel özelliği biyokimyasal olmalıdır. Boncuklar, Ng-CAM, başlangıçta 2 karakterize etmek için kullanıldı ise de, bu deneyler, kaderin-aracılı adhezyon 12,14,15 araştırmak amacıyla genişletilmiştir. C-kaderin ekto-Fc füzyon füzyonlarının kullanarak, çok sayıda laboratuar Gumbiner kadherin tekrarlar etkileşimleri 14 homofilik katkıda bulunduğunu göstermiştir. Drosophila 'dan gelen protocadherins 1,15-18 ve Dscam izoformlarının bir dizi gibi benzer topuk kısmı agregasyon analizleri, E-kadherin ve N-kadherin yapışma kullanılması da, 12,15 karakterize edilmiştir <em> 19. Burada farazi homofilik kamları (Şekil 1), salgılanan, epitop ektoalanlarının yapışma aktivitesini karakterize etmek için nispeten basit ve hızlı bir deneyi tarif eder. Biz öncelikle kaderin süperailesinin üyelerini karakterize bu tahlili kullandık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre yapışması, çok hücreli yaşamının önemli bir özelliğidir ve hücre yüzey proteinleri, geniş bir dizi aracılık eder. Bunlardan, ayrıntılı, yapışkan özellikleri sadece nispeten küçük bir kısmı için anlaşılır. Burada, uygun bir epitop ucuna birleştirilen bir salgılanan ektoalanlarının homofilik yapışkanlı araştırmak için basit, hızlı bir protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, önemli avantajlara sahiptir. Amaçla yeterli miktarlarda protein, 100 mm'lik tabaklar geçi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
| pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
| HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
| DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
| 100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
| Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
| Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
| Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
| Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
| 0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
| Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
| Table of Buffers/Solutions | ||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neurosciences. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neurosciences. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
