Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle
Summary
Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.
Abstract
Zell-Zell-Adhäsion ist von grundlegender Bedeutung für Vielzeller und wird durch eine Vielfalt von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Jedoch sind die adhäsiven Wechselwirkungen vieler dieser Proteine schlecht verstanden. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der Hafteigenschaften von mutmaßlichen homophile Zell-Adhäsionsmoleküle. Kultivierten HEK293-Zellen mit Plasmid-DNA, kodierend eine sekretierte, Epitop-tagged Ektodomäne eines Zelloberflächenprotein transfiziert. Unter Verwendung von für die Epitop-Markierung funktionalisierten Kügelchen wird das lösliche, sekretierte Fusionsprotein aus dem Kulturmedium festgehalten. Die beschichteten Perlen können dann direkt in Perlenaggregationstests oder fluoreszierende Perle Sortier Assays für homophile Adhäsion zu prüfen. Falls gewünscht, kann die Mutagenese dann verwendet, um die spezifische Aminosäuren oder Domänen für die Haftung erforderlichen aufzuklären. Dieser Test erfordert nur geringe Mengen an exprimiertem Protein, nicht die Herstellung von stabilen Zelllinien erfordern, und kann acco werdeninnerhalb von 4 Tagen mplished.
Introduction
Zell-Zell-Adhäsion ist wesentlich für die Entwicklung und die Integrität von mehrzelligen Organismen und durch eine Vielfalt von Zelloberflächenmolekülen vermittelt. Viele dieser Adhäsionsmoleküle wurden identifiziert und charakterisiert, obwohl viele noch zu entdecken sind. Verschiedene Methoden werden verwendet, um die Eigenschaften von Zelladhäsionsmolekülen (CAMs), einschließlich Zellsortierung Assays, Zellaggregationsassays 1-8 und biophysikalische Methoden, wie die Rasterkraftmikroskopie und Oberflächenkraftspektroskopie 9-12 untersuchen.
Die Komplexität auch in vitro-Systemen unter Verwendung von Zelllinien vereinfacht macht es schwierig, die Hafteigenschaften eines mutmaßlichen CAM bestimmen. Typischerweise wird ein Molekül als ein CAM, wenn die Zellaggregation induziert, wenn sie in einem nicht-klebenden Zelllinie transfiziert. Es ist jedoch klar, dass dies keine direkte Hinweise auf Haftungsaktivität. Beispielsweise erleichtert die Zelloberfläche Lieferung oder Stabilität einesCAM würde auch zu einer erhöhten Zellaggregation 1,13 führen. Darüber hinaus kann eine wahre CAM nicht, Zellaggregation vermitteln, wenn die Zelllinie fehlt anderen Co-Faktoren für Zelloberflächen Lieferung oder Stabilisierung erforderlich.
Um diese erschwerenden Faktoren zu vermeiden, mehr direkte Assays eingesetzt werden, die auf der Idee basieren, dass adhäsive Wechselwirkungen sollte eine intrinsische biochemische Eigenschaft der extrazellulären Domäne sein. Während Perlen wurden zunächst zur Ng-CAM 2 zu charakterisieren, haben diese Tests, um Cadherin-vermittelte Adhäsion 12,14,15 untersuchen erweitert. Verwendung Fusion des C-Cadherin-Ektodomäne-Fc-Fusionen zeigten die Gumbiner Labor dass mehrere Cadherin Wiederholungen tragen zu Interaktionen 14 homo. Mit vergleichbaren Wulst Aggregationstests, E-Cadherin und N-Cadherin-Haft wurden ebenfalls gekennzeichnet 12,15, als eine Reihe von Protocadherinen 1,15-18 und Dscam Isoformen von Drosophila haben <em> 19. Hier beschreiben wir einen relativ einfachen und schnellen Test zur Charakterisierung der Klebstoff Aktivität sezerniert Epitop markierte Ektodomäne von mutmaßlichen homo Nocken (Abbildung 1). Wir haben diesen Test verwendet hauptsächlich die Mitglieder der Cadherin-Oberfamilie charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zelladhäsion ist ein wesentliches Merkmal der vielzelligen Leben und wird von einem breiten Spektrum von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Von diesen sind die detaillierten Klebeeigenschaften nur für einen relativ kleinen Anteil verstanden. Hier haben wir ein einfaches, schnelles Protokoll zur Untersuchung der homophile Haftfähigkeit von sekretierten Ektodomänen in einem geeigneten Epitop-Tag fusioniert beschrieben. Dieser Ansatz hat eine Reihe von wichtigen Vorteilen. Zuerst werden die stabilen Zelllinien nicht…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NSF/ARRA award (IOS 0920357) and an award from the NIH (5R21MH098463).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Catalog Number | Company |
| pFc-N1 plasmid | To be submitted | Addgene |
| HEK293 cells | CRL-1573 | American Type Culture Collection |
| DMEM | 10-013-CV | Mediatech – Corning |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | F2442 | Sigma |
| 100X Pen-Strep (10,000 U/ml) | 15140-122 | Life Technologies |
| 0.05% Trypsin-EDTA | 25300054 | Life Technologies |
| Lipofectamine 2000 | 11668030 | Life Technologies |
| Dynabeads – Protein G | 10003D | Life Technologies |
| Bovine Serum Albumin | A3294 | Sigma |
| Depression slides | 71878-06 | Electron Microscopy Sciences |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | UFC901024 | Millipore |
| 0.45mm syringe filter | 83.1826 | Sarstedt |
| Dynamag-2 Magnet | 12321D | Life Technologies |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | |
| Table of Buffers/Solutions | ||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Growth Media – FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4°C. |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. |
References
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