Modélisation astrocytome pathogenèse<em> In Vitro</em> Et<em> In Vivo</em> Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Les astrocytomes sont tumeur la plus fréquente primaire du cerveau et le glioblastome (GBM), un astrocytome de grade IV, est le sous-type le plus commun et agressif avec une survie médiane de 1,2 mois 12-15. Invasion de astrocytomes diffus, en particulier GBM, s'oppose à la résection chirurgicale complète, limite l'efficacité des traitements adjuvants, et conduit inévitablement à un post-traitement récidive 3. Les patients initialement présents soit avec de novo (primaire) GBM ou l'astrocytome de grade inférieur qui progresse inévitablement (secondaire) GBM 4. GBM est hétérogène sur le plan génomique et caractérisé par des mutations qui s'excluent mutuellement et concomitants dans trois gènes qui régissent les voies de signalisation: la base G 1 / S (Rb) de point de contrôle du cycle cellulaire, le récepteur tyrosine kinase (RTK), et TP53 cheminements de 5-7. GBM est composée de quatre sous-types génomiques avec des profils d'expression distincts qui ressemblent à différents types de cellules du cerveau, suggérant que le sous-type GBM est influtionnés par sa cellule d'origine 6,8,9. Modèles d'astrocytome de meilleure qualité sont nécessaires pour définir le rôle des combinaisons spécifiques de mutations dans certains types cellulaires au cours de l'astrocytome pathogenèse. S'appuyant sur ces modèles pour le développement préclinique de médicaments plus efficaces en fin de compte contribuer à améliorer les résultats des patients. Modèles d'astrocytome actuelles comprennent des lignées cellulaires humaines, dérivées patient xénogreffes (PDX), les astrocytes humains normaux génétiquement modifiés et les cellules souches neurales (CSN) et des souris génétiquement modifiées (GEM) 10-14. Nous avons développé une solution de rechange, GEM non germinale (nGEM) modèle 15 utilisant des cellules cérébrales primaires – astrocytes corticaux et NSC – récoltées à partir de GEM abritant diverses combinaisons d'allèles oncogènes Floxé. L'objectif était de produire des modèles d'astrocytome avec des cellules génétiquement définies que l'on pourrait qualifier phénotypique à la fois in vitro et in vivo et potentiellement utilisés pour le développement préclinique de médicaments en isouris mmune-compétentes.
Lignées établies de cellules humaines sont le modèle le plus couramment utilisé de l'astrocytome pathogenèse et la réponse aux médicaments in vitro et in vivo. Ils sont techniquement simple, largement disponibles, et ont défini la cinétique et la tumorigénicité sur la xénogreffe orthotopique chez des souris immunodéficientes 10,11,16-18 . Leurs inconvénients comprennent l'incapacité à générer des lignées cellulaires établies à partir des astrocytomes de bas grade, ce qui limite l'étude que pour les astrocytomes de haut grade; l'absence d'une cellule définie d'origine; la présence d'anomalies génomiques complexes, souvent avec des profils génomiques qui diffèrent nettement de l'échantillon du patient d'origine; et la susceptibilité à phénotypique et génotypique dérive pendant une série de culture dans le sérum 11,17,19-22. Les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques individuels dans des lignées cellulaires de glioblastome humaines établies peuvent être masquées par la multitude des anomalies qui sont effectivement présents, ce qui empêche souvent elucdation des conséquences directes génotype-phénotype.
PDX sont générés par le passage sous-cutanée de cellules d'astrocytome patient isolé dans des souris immunodéficientes ou par leur culture sous forme de sphéroïdes non-adhérentes dans un milieu défini sans sérum avant l'injection orthotopique dans le cerveau de souris immunodéficientes 12,23. PDX conserver avec plus de précision le paysage génomique d'astrocytomes humains, mais proche de lignées établies de cellules humaines, l'effet phénotypique de mutations oncogéniques individuels peuvent être masquées en raison de leur complexité génomique 19,24. Pour définir les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques spécifiques, en particulier en réponse à de nouvelles thérapies, les panneaux de lignées cellulaires humaines établies ou PDX sont fréquemment utilisées pour établir des corrélations génotype-phénotype, montrer généralisation, et minimiser la probabilité d'effets spécifiques aux lignes cellulaires. Alors que PDX récapituler avec précision les caractéristiques histopathologiques de l'astrocytome humain, incLUDING invasion, xénogreffes orthotopiques de lignées établies de cellules humaines font généralement pas 21,23,25. Par ailleurs, les astrocytes humains normaux et NSC ont été modifiés par génie génétique des mutations oncogéniques définis pour modéliser astrocytome la tumorigenèse in vitro et in vivo 13,14,26. Ces cellules n'ont pas la complexité du génome de lignées cellulaires humaines établies et PDX et récapitulent précision histopathologie astrocytome humain, mais nécessitent xénogreffe chez les rongeurs immunodéprimés in vivo. Parce que tous les modèles de cellules humaines nécessitent hôtes rongeurs immunodéprimés pour prévenir le rejet de xénogreffe à médiation immunitaire, ces modèles ne permettent pas de récapituler les interactions tumeur-stroma natif d'un système syngénique et manquent d'un système immunitaire intact, ce qui limite investigation préclinique d'immuno-modulatrice du stroma ciblée et thérapies 10,11.
GEM examen du permis de les conséquences phénotypiques de combinaisons prédéterminées de muta oncogènetions in vivo au cours de la tumorigenèse in situ. Considérant que GEM non conditionnelle ont des mutations dans tous les tissus au cours du développement, GEM conditionnelle ont floxé allèles oncogènes qui permettent le ciblage des mutations en limitant la recombinaison médiée par Cre à des types spécifiques de cellules grâce à l'utilisation de cellules promoteurs spécifiques de type 10,11,15,18. Astrocytome GEM conditionnelle ont été utilisés pour élucider les rôles fonctionnels des mutations oncogéniques dans des types cellulaires distincts au sein d'un cerveau intact 11. L'utilitaire préclinique de gliomagenèse in situ en utilisant GEM conditionnelle est limitée par un certain nombre de facteurs, y compris 1) l'absence d'une corrélation in vitro, 2) la difficulté à générer de grandes cohortes de souris avec des génotypes complexes, 3) longue période de latence du développement tumoral in situ , 4) et stochastique progression tumorale. Parce que la tumorigenèse in situ manque un modèle in vitro correspondant, le test de médicament in vitro ne peut être réalisée avecmodèles conditionnels classiques vec GEM. Contrairement à d'autres cancers, les modèles GEM conditionnelles des astrocytomes sont rarement induites par des mutations oncogéniques individuelles 11. Ainsi, les programmes de sélection complexes sont nécessaires pour produire GEM conditionnelle avec de multiples mutations oncogéniques. En outre, l'astrocytome initiation se produit avec une pénétrance variable après une longue période de latence dans ces modèles, alors que la progression de l'astrocytome de haut grade se produit généralement dans un non-uniforme, stochastique manière et donne finalement naissance à des tumeurs avec des paysages génomiques complexes et de la cinétique de croissance rapide 27, 28. La pénétrance variable et la nature stochastique de la progression maligne dans les modèles GEM conditionnelles exige que les souris individuelles seront examinées par imagerie radiographique pour détecter la présence et l'emplacement des astrocytomes de haut grade avant leur inscription dans les essais de médicaments précliniques. Pris ensemble, ces limites entravent la production et les essais des grandes cohortes de GEM conditionnelle requis pour prdépistage des drogues eClinique.
Le système de GEM RCAS-tva, qui utilise rétroviraux aviaires (CR) des vecteurs d'infecter GEM modifié pour exprimer le récepteur viral (tva) sur des types spécifiques de cellules neurales, a été largement utilisé pour modéliser l'astrocytome 11 tumorigenèse. Contrairement à GEM conditionnelle, ce système modèle permet l'introduction de multiples mutations oncogènes des types de cellules spécifiques sans l'obligation pour les programmes de sélection complexes. Toutefois, il est limité par une pénétrance variable, l'exigence de cellules en division active pour réaliser l'intégration virale, et l'insertion aléatoire de transgènes dans le génome de l'hôte 29.
Non germinales GEM (nGEM) modèles, qui utilisent les cellules récoltées à partir de GEM, sont de plus en plus important car ils surmonter bon nombre des limitations d'autres systèmes modèles 15. Le rôle d'initiateur de type cellulaire et des mutations concomitants dans l'astrocytome pathogenèse sont difficiles à dissuaderla mine en utilisant des lignées de cellules humaines de glioblastome ou PDX parce qu'ils sont issus de tumeurs en phase terminale qui ont accumulé de vastes mutations génétiques dans des types cellulaires définis au cours de la progression maligne. En revanche, toutes les qualités de astrocytomes peuvent être modélisés à l'aide nGEM en induisant défini mutations génétiques dans les types de cellules du cerveau purifiés spécifiques 11,30. Ainsi, l'influence de mutations génétiques spécifiques et le type de cellule sur des phénotypes cellulaires et moléculaires peut être déterminée in vitro et in vivo. Similaires à des lignées de cellules de glioblastome humaines établies, le test initial de médicament in vitro à l'aide nGEM peut être utilisé pour établir des priorités des médicaments pour les essais in vivo en utilisant les mêmes cellules. Tumorigenèse in vivo peut être déterminée par allogreffe de cellules nGEM orthotopique dans le cerveau de la même portée syngéniques immunocompétentes 30. Ces modèles d'allogreffe orthotopique permettent donc de tester in vivo non seulement de classique cytotoxique unee thérapies ciblées, mais immuno-modulateur et les thérapies ciblées stroma ainsi. Enfin, le rôle du micro-environnement sur l'initiation et la progression de la tumeur peut être déterminée par la comparaison des résultats entre les modèles et nGEM GEM classiques en utilisant les mêmes mutations dans les mêmes types de cellules.
Nous et d'autres avons développé astrocytome nGEM utilisant des cellules primaires – les astrocytes, NSC, ou de cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) – récoltées à partir de GEM 30-34. La raison d'être de l'élaboration d'un astrocytome nGEM était de créer un modèle pour déterminer les conséquences phénotypiques de mutations oncogéniques dans des types cellulaires spécifiques qui pourraient être utilisés pour les essais préclinique in vitro et in vivo chez l'animal immuno-compétentes. Nous avons récolté les astrocytes phénotype WT corticales et NSC à partir du non-Cre exprimant, GEM conditionnelle maintenu sur un> 94% C57 / BL6 fond avec la voie RB floxé – Rb1 loxP / loxP, ou TgGZT121 – et Floxé RTK / RAS / PI3K voie – Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, PTEN loxP / loxP – gènes dans diverses combinaisons 35-39. Nous avons provoqué la recombinaison génétique in vitro en utilisant des vecteurs adénoviraux codant pour la recombinase Cre. Étant donné que les récoltes d'astrocytes corticaux contiennent un mélange de types de cellules, nous avons utilisé des vecteurs ou des transgènes Ad5GFAPCre oncogènes dominants, tels que TgGZT 121 entraîné par le promoteur de la GFAP humain, pour enrichir GFAP pour les astrocytes corticaux + dans ces cultures. Nous avons défini les conséquences phénotypiques de G 1 / S (Rb), MAPK, et les mutations de la voie de la PI3K dans les astrocytes corticaux et NSC in vitro et in vivo. MAPK et PI3K activée par voie G1 / S défectueux astrocytes moléculaire imitée de glioblastome humain proneural et, lors de l'injection orthotopique, tumeurs formées dans un endroit pré-défini avec une cinétique de croissance uniformes, des latences courtes, et la histopathologiquescaractéristiques al de GBM humain 30. Surveillance longitudinale de la croissance tumorale in vivo facilite le dépistage des drogues à travers la normalisation préclinique de cohortes de traitement et d'analyse quantitative de la croissance de la tumeur en réponse à un traitement 40. Nous avons déterminé la cinétique de croissance de la tumeur par imagerie par bioluminescence longitudinal de souris injectées avec les astrocytes corticaux exprimant la luciférase. Par conséquent, les astrocytes corticaux et NSC dérivées de GEM conditionnelle fournissent un système de modèle souple pour la définition des conséquences fonctionnelles des mutations d'astrocytome-associé et un système de modèle potentiel pour le développement préclinique de médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques pour assurer la récolte et la culture d'astrocytes corticaux sont 1) le bon d'exciser le cortex sans prendre le tissu situé sous le corps calleux, 2) pour enlever les méninges, 3) de dissocier complètement les cellules, et 4) pour enrichir pour GFAP + astrocytes. Bien que nous utilisions mécanique (agitation) et génétiques (restriction d'une recombinaison génétique avec un vecteur d'Ad5GFAPCre ou l'utilisation d'un transgène de transformation do…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
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