Моделирование Астроцитома Патогенез<em> In Vitro</em> И<em> В Vivo</em> Использование кортикальной астроциты или нервные стволовые клетки из условного, генной инженерии мышей
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Астроцитомы наиболее распространенной первичной опухоли головного мозга и глиобластомы (GBM), IV астроцитома класса, является наиболее распространенным и агрессивным подтипом при медиане выживаемости 12-15 месяцев 1,2. Вторжение диффузных астроцитом, в частности GBM, исключает полное хирургическое удаление, ограничивает эффективность адъювантной терапии, и неизбежно приводит к рецидиву после лечения 3. Пациенты, изначально присутствующие либо с De Novo (первичной) GBM или с более низкими астроцитом класса, что неизбежно прогрессирует в (вторичной) GBM 4. GBM является геномно неоднородна и характеризуется взаимоисключающих и сопутствующих мутаций в генах, которые регулируют три основных сигнальных путей: G 1 / S (Rb) клеточного цикла контрольных точек, рецептора тирозинкиназы (RTK), и TP53 дорожками 5-7. GBM состоит из четырех геномных подтипов с различными профилями экспрессии, которые напоминают различные типы клеток мозга, предполагая, что GBM подтип ВЛИянием его клетки происхождения 6,8,9. Лучшие модели астроцитома обязаны определить роль конкретных комбинаций мутаций в определенные клеточные типы во астроцитому патогенезе. Используя эти модели для более эффективного развития доклинических наркотиков в конечном итоге поможет улучшить результаты лечения пациентов. Современные модели астроцитома включают установлены клеточные линии человека, пациента происходит ксенотрансплантаты (PDX), генетически модифицированные нормальные человеческие астроциты и нервные стволовые клетки (НСК) и генно-инженерных мышей (GEM) 10-14. Мы разработали альтернативный, не-зародышевой линии GEM (nGEM) модель 15 с использованием первичных клеток мозга – коры астроциты и NSC – найденным GEM, несущего различные комбинации floxed онкогенных аллелей. Целью было генерации моделей Астроцитома с генетически определенных клеток, которые могут быть фенотипически характеризующихся как в пробирке и в естественных и потенциально используемых для доклинической разработки лекарственных средств в Immune-компетентные мышей.
Штатные клеточные линии человека являются наиболее часто используется модель патогенеза астроцитому и ответ наркотиков в пробирке и в естественных условиях. Они технически прямо вперед, широко доступны, и определили кинетики и онкогенность на ортотопического ксенотрансплантации в иммунодефицитных мышей 10,11,16-18 . Их недостатки включают неспособность генерировать установленные клеточные линии из низкосортных астроцитом, ограничивая исследование только к высокой астроцитом; Отсутствие определенной ячейке происхождения; наличие сложных геномных нарушений, часто с геномных профилей, которые заметно отличаются от оригинального образца пациента; и восприимчивость к фенотипической и генотипической дрейфа во серийного культуры в сыворотке 11,17,19-22. Фенотипические последствия отдельных онкогенных мутаций в установленных клеточных линий человека GBM может маскироваться множества нарушений, которые на самом деле присутствует, которые часто исключает elucidation прямых последствий генотип-фенотип.
PDX генерируются через подкожной прохождения пациентом изолированы клетках астроцитомы в иммунодефицитных мышей или через их культуры как неадгезивных сфероидов в определенном, сыворотки среде до ортотопического инъекции в мозг иммунодефицитных мышей 12,23. PDX более точно поддерживать геномной ландшафт человека астроцитомы, но аналогично установленных клеточных линий человека, фенотипический эффект отдельных онкогенных мутаций могут быть замаскированы в связи с их геномной сложности 19,24. Чтобы определить фенотипические последствия конкретных онкогенных мутаций, особенно в ответ на новые методы лечения, панели, установленные клеточных линий или PDX человека часто используются, чтобы установить генотип-фенотип корреляции, показать обобщения, и свести к минимуму вероятность линии конкретных эффектов клеток. В то время как PDX точно воспроизводят гистопатологические признаки человеческой астроцитомы, IncЛУДИНГ вторжение, Ортотопическая ксенотрансплантаты из установленных клеточных линий человека вообще не 21,23,25. Кроме того, нормальные человеческие астроциты и НСК были генной инженерии с определенными онкогенных мутаций моделировать Астроцитома туморогенез в пробирке и в естественных 13,14,26. Эти клетки имеют геномную сложность установленных клеточных линий и PDX человека и точно воспроизводят человеческую Астроцитома гистопатологию, но требуют ксенотрансплантации в иммунодефицитных грызунов в естественных условиях. Потому что все модели клеток человека требуют иммунодефицитом грызунов для предотвращения иммунной опосредованного отторжения ксенотрансплантата, эти модели не резюмировать родные опухоли стромы взаимодействия сингенной системы и не имеют интактную иммунную систему, ограничивая доклинические исследования стромы целенаправленной и иммунной-модуляторных виды терапии, 10,11.
GEM разрешение экспертиза фенотипических последствий заранее определенных комбинаций онкогенного Мутания в естественных условиях в течение на месте туморогенеза. В то время как не-условное GEM есть мутаций внутри всех тканях в течение всего развития, условно GEM уже floxed онкогенные аллели, которые позволяют адресности мутаций путем ограничения Cre-опосредованной рекомбинации определенными типами клеток путем использования типоспецифических промоутеров клеток 10,11,15,18. Условный астроцитома GEM были использованы для выяснения функциональные роли онкогенных мутаций в различных типах клеток в интактным мозгом 11. Доклинические полезность на месте gliomagenesis помощью условного GEM ограничивается рядом факторов, включая 1) Отсутствие коррелят в пробирке, 2) трудности в формировании большие когорты мышей со сложными генотипов, 3) с длительным латентным периодом в развитии опухоли Ситу , 4) и стохастического прогрессирование опухоли. Поскольку на месте канцерогенез отсутствует модель, соответствующую в пробирке, тестирование препарата в пробирке не может быть выполнена WIth обычные условные модели GEM. В отличие от других видов рака, условные модели GEM астроцитомы редко, индуцированный отдельных онкогенных мутаций 11. Таким образом, сложные схемы размножения требуются для создания условного GEM с несколькими онкогенных мутаций. Кроме того, астроцитома инициация происходит с переменной пенетрантностью после длительного латентного в этих моделях, в то время как прогрессирование до высокого астроцитом обычно происходит в неоднородном, стохастического образом и в конечном итоге приводит к опухоли со сложными геномных пейзажей и стремительных кинетики роста 27, 28. Переменная пенетрантность и стохастический характер злокачественной прогрессии в условных моделей GEM требует, чтобы отдельные мышей быть экранированы рентгенографии для обнаружения присутствия и местоположения высокого астроцитом до их зачисления в доклинических испытаний лекарств. Взятые вместе, эти ограничения препятствуют поколения и тестирование крупных когорт условного GEM, необходимое для прeclinical тестирование на наркотики.
GEM система RCAS-тва, которые использует птичьего ретровирусов (Rcas) векторы заразить GEM инженерии выразить вирусный рецептор (TVA) по конкретным нейронных типов клеток, широко используется для моделирования Астроцитома туморогенез 11. В отличие от условного GEM, эта модель система позволяет введение нескольких онкогенных мутаций в определенных типах клеток без необходимости сложных схем селекции. Тем не менее, она ограничена переменной пенетрантностью, требование для активно делящихся клеток для достижения вирусного интеграции, и случайной вставки трансгенов в геном хозяина 29.
Номера для зародышевой линии GEM (nGEM) модели, которые используют клетки, полученные из GEM, становятся все более важными, потому что они преодолеть многие из ограничений других модельных систем 15. Роль инициирования типа клеток и сопутствующих мутаций в астроцитому патогенезе трудно сдерживатьшахта с использованием установленных клеточных линий GBM человека или PDX, потому что они являются производными от терминальной стадии опухоли, которые накопились обширные генетические мутации в неопределенных типов клеток в ходе злокачественной прогрессии. В отличие от этого, все сорта астроцитомы могут быть смоделированы с помощью nGEM путем индукции определяется генетические мутации в определенных очищенных типы клеток мозга 11,30. Таким образом, влияние специфических генетических мутаций и типа клеток на клеточном и молекулярном фенотипов может быть определена в пробирке и в естественных условиях. Как и в установленных клеточных линий человека GBM, начальная пробирке тестирования на наркотики при помощи nGEM могут быть использованы по приоритетам препараты для тестирования в естественных условиях, использующие одни и те же клетки. Опухолей ин виво может быть определена путем аллотрансплантации nGEM клетки ортотопически в мозг иммунокомпетентных сингенных помета 30. Эти Ортотопическая модели аллотрансплантатов поэтому позволяют в естественных условиях тестирования не только обычных цитотоксической ай целевой терапии, но иммунная-модуляторный и строме ориентированные виды терапии, а также. И, наконец, роль микроокружения на инициации и прогрессирования опухоли могут быть определены путем сравнения результатов между nGEM и обычные модели GEM с использованием тех же мутации в тех же типах клеток.
Мы и другие разработали Астроцитома nGEM использованием первичных клеток – астроцитов, NSC или клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC) – найденным GEM 30-34. Обоснованием разработке астроцитомой nGEM было создать модель для определения фенотипические последствия онкогенных мутаций в специфические типы клеток, которые потенциально могут быть использованы для доклинических испытаний препарата в пробирке и в естественных в иммунокомпетентных животных. Мы собрали фенотипически WT корковых астроциты и NSC от не-Cre выражающие, условное GEM поддерживается на> 94% C57 / BL6 фоне с floxed РБ пути – Rb1 LoxP / LoxP или TgGZT121 – и floxed RTK / РАН / PI3K пути – nf1 LoxP / LoxP, Крас G12D, PTEN LoxP / LoxP – гены в различных комбинациях 35-39. Мы индуцированной генетической рекомбинации в пробирке с помощью аденовирусные векторы, кодирующие Cre рекомбиназу. Поскольку корковые астроцитов урожаи содержат смесь типов клеток, мы использовали Ad5GFAPCre векторы или доминирующие онкогенные трансгены, такие как TgGZT 121 приводится в движение от промотора GFAP человека, для обогащения GFAP + кортикальных астроцитов в этих культурах. Мы определили фенотипические последствия G 1 / S (РБ), MAPK, и пути PI3K мутаций в корковых астроциты и НСК в пробирке и в естественных условиях. МАРК и PI3K пути активированные G1 / S-неполноценные астроциты молекулярно передразнил человек пронейральный GBM и, по ортотопического инъекции, образованные опухоли в заранее определенном месте с единых кинетики роста, короткие задержки, и гистологическиеаль отличительными чертами человеческого GBM 30. Продольный контроль роста опухоли в естественных условиях помогает доклинические испытания препарата через нормализации лечения когорт и количественного анализа роста опухоли в ответ на лечение 40. Мы определили кинетики роста опухоли по продольной биолюминесценции визуализации мышей, которым вводили люциферазы выражая корковых астроциты. Поэтому корковых астроциты и НСК, полученные из условного GEM обеспечить послушный модельную систему для определения функциональных последствий астроцитомы мутаций, связанных и потенциального модельной системы для доклинической разработки лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для обеспечения надлежащего урожай и культуру корковых астроциты 1), чтобы вырезать кору, не принимая ткани ниже мозолистого тела, 2) для удаления оболочки мозга, 3), чтобы тщательно отделить клетки, и 4) для обогащения GFAP + астроциты. Хотя мы использовали механич?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
References
- Dolecek, T. A., Propp, J. M., Stroup, N. E., Kruchko, C. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009. Neuro Oncol. 14, 1-49 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal Of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Giese, A., Bjerkvig, R., Berens, M. E., Westphal, M. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment. J. Clin. Oncol. 21 (8), 1624-1636 (2003).
- Miller, C. R., Perry, A. Glioblastoma. Arch. Pathol. Lab. Med. 131 (3), 397-406 (2007).
- . Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Phillips, H. S., et al. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9 (3), 157-173 (2006).
- Vitucci, M., Hayes, D. N., Miller, C. R. Gene expression profiling of gliomas: merging genomic and histopathological classification for personalised therapy. Br. J. Cancer. 104 (4), 545-553 (2011).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Schmid, R. S., Vitucci, M., Miller, C. R. Genetically engineered mouse models of diffuse gliomas. Brain Res. Bull. 88 (1), 72-79 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Sonoda, Y., et al. Formation of intracranial tumors by genetically modified human astrocytes defines four pathways critical in the development of human anaplastic astrocytoma. Cancer Res. 61 (13), 4956-4960 (2001).
- Mao, X. G., et al. LIN28A facilitates the transformation of human neural stem cells and promotes glioblastoma tumorigenesis through a pro-invasive genetic program. Oncotarget. 4 (7), 1050-1064 (2013).
- Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research. Nat. Rev. Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).
- Miller, C. R., Williams, C. R., Buchsbaum, D. J., Gillespie, G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. Cancer Res. 62 (3), 773-780 (2002).
- Becher, O. J., Holland, E. C. Genetically engineered models have advantages over xenografts for preclinical studies. Cancer Res. 66 (7), 3355-3358 (2006).
- Huse, J. T., Holland, E. C. Genetically engineered mouse models of brain cancer and the promise of preclinical testing. Brain Pathol. 19 (1), 132-143 (2009).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Li, A., et al. Genomic changes and gene expression profiles reveal that established glioma cell lines are poorly representative of primary human gliomas. Mol. Cancer Res. 6 (1), 21-30 (2008).
- Vries, N. A., Beijnen, J. H., van Tellingen, O. High-grade glioma mouse models and their applicability for preclinical testing. Cancer Treat. Rev. 35 (8), 714-723 (2009).
- Clark, M. J., et al. U87MG decoded: the genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 6 (1), (2010).
- Carvalho, A. C., et al. Gliosarcoma stem cells undergo glial and mesenchymal differentiation in vivo. Stem Cells. 28 (2), 181-190 (2010).
- Yost, S. E., et al. High-resolution mutational profiling suggests the genetic validity of glioblastoma patient-derived pre-clinical models. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Giannini, C., et al. Patient tumor EGFR and PDGFRA gene amplifications retained in an invasive intracranial xenograft model of glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 7 (2), 164-176 (2005).
- Rich, J. N., Guo, C., McLendon, R. E., Bigner, D. D., Wang, X. F., Counter, C. M. A genetically tractable model of human glioma formation. Cancer Res. 61 (9), 3556-3560 (2001).
- Chow, L. M., et al. Cooperativity within and among Pten, p53, and Rb pathways induces high-grade astrocytoma in adult brain. Cancer Cell. 19 (3), 305-316 (2011).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).
- Werder, A., Seidler, B., Schmid, R. M., Schneider, G., Saur, D. Production of avian retroviruses and tissue-specific somatic retroviral gene transfer in vivo using the RCAS/TVA system. Nat. Protoc. 7 (6), 1167-1183 (2012).
- Vitucci, M., et al. Cooperativity between MAPK and PI3K signaling activation is required for glioblastoma pathogenesis. Neuro Oncol. 15 (10), 1317-1329 (2013).
- Yahanda, A. M., Bruner, J. M., Donehower, L. A., Morrison, R. S. Astrocytes derived from p53-deficient mice provide a multistep in vitro model for development of malignant gliomas. Mol. Cell. Biol. 15 (8), 4249-4259 (1995).
- McEllin, B., et al. PTEN loss compromises homologous recombination repair in astrocytes: implications for glioblastoma therapy with temozolomide or poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors. Cancer Res. 70 (13), 5457-5464 (2010).
- Kim, H. S., et al. Gliomagenesis arising from Pten- and Ink4a/Arf-deficient neural progenitor cells is mediated by the p53-Fbxw7/Cdc4 pathway, which controls c-Myc. Cancer Res. 72 (22), 6065-6075 (2012).
- Radke, J., Bortolussi, G., Pagenstecher, A. Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice. PLoS One. 8 (2), (2013).
- Marino, S., Vooijs, M., Der Gulden, H. v. a. n., Jonkers, J., Berns, A. Induction of medulloblastomas in p53-null mutant mice by somatic inactivation of Rb in the external granular layer cells of the cerebellum. Genes Dev. 14 (8), 994-1004 (2000).
- Zhu, Y., et al. Ablation of NF1 function in neurons induces abnormal development of cerebral cortex and reactive gliosis in the brain. Genes Dev. 15 (7), 859-876 (2001).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Xiao, A., Wu, H., Pandolfi, P. P., Louis, D. N., Van Dyke, T. Astrocyte inactivation of the pRb pathway predisposes mice to malignant astrocytoma development that is accelerated by PTEN mutation. Cancer Cell. 1 (2), 157-168 (2002).
- Xiao, A., Yin, C., Yang, C., Di Cristofano, A., Pandolfi, P. P., Van Dyke, T. Somatic induction of Pten loss in a preclinical astrocytoma model reveals major roles in disease progression and avenues for target discovery and validation. Cancer Res. 65 (12), 5172-5180 (2005).
- Neill, K., Lyons, S. K., Gallagher, W. M., Curran, K. M., Byrne, A. T. Bioluminescent imaging: a critical tool in pre-clinical oncology research. J. Pathol. 220 (3), 317-327 (2010).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J. Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Miller, C. R., Bash, R. E., Vitucci, M., White, K. K. A genetically-defined, orthotopic allograft model system of glioblastoma: Pathological features and experimental therapeutics. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69 (5), 522 (2011).
- Bash, R., et al. Concurrent temozolomide-external beam radiation therapy is effective for experimental glioblastomas in an orthotopic, genetically engineered syngeneic mouse allograft model system. Neuro Oncol. 11 (5), 638 (2009).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J. Neurosci. Meth. 150 (1), 128-137 (2006).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Rietze, R. L., Valcanis, H., Brooker, G. F., Thomas, T., Voss, A. K., Bartlett, P. F. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412 (6848), 736-739 (2001).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu. Rev. Physiol. 75, 685-705 (2013).
- Sirko, S., et al. Reactive glia in the injured brain acquire stem cell properties in response to sonic hedgehog. Cell stem cell. 12 (4), 426-439 (2013).
- Robel, S., Berninger, B., Gotz, M. The stem cell potential of glia: lessons from reactive gliosis. Nat. Rev. Neurosci. 12 (2), 88-104 (2011).
- Burrell, K., Agnihotri, S., Leung, M., Dacosta, R., Hill, R., Zadeh, G. A novel high-resolution in vivo imaging technique to study the dynamic response of intracranial structures to tumor growth and therapeutics. J. Vis Exp. e50363 (76), (2013).
- Sottoriva, A., et al. Intratumor heterogeneity in human glioblastoma reflects cancer evolutionary dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4009-4014 (2013).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer Cell. 20 (6), 810-817 (2011).
