Modellazione Astrocitoma Patogenesi<em> In Vitro</em> E<em> In Vivo</em> Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati
Summary
Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.
Abstract
Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.
Introduction
Astrocitomi sono il tumore cerebrale primario più comune e glioblastoma (GBM), un astrocitoma di grado IV, è il sottotipo più comune e aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 12-15 mesi 1,2. Invasione di astrocitomi diffusi, in particolare GBM, preclude la resezione chirurgica completa, limita l'efficacia delle terapie adiuvanti, e porta inevitabilmente alla post-trattamento recidiva 3. I pazienti inizialmente presenti sia con de novo (primario) GBM o con astrocitoma di grado inferiore che progredisce inevitabilmente (secondaria) GBM 4. GBM è genomicamente eterogeneo e caratterizzato da mutazioni si escludono a vicenda e co-si verificano in geni che governano tre principali vie di segnalazione: G 1 / S (Rb) checkpoint del ciclo cellulare, il recettore tirosin chinasi (RTK), e TP53 Percorsi di 5-7. GBM è composto da quattro sottotipi genomiche con profili di espressione distinti che assomigliano a diversi tipi di cellule del cervello, suggerendo che GBM sottotipo è influenfluenzati dalla sua cella di origine 6,8,9. Modelli di astrocitoma migliori sono tenuti a definire il ruolo di specifiche combinazioni di mutazioni in particolari tipi di cellule durante astrocitoma patogenesi. Sfruttando questi modelli per lo sviluppo di farmaci più efficaci preclinico in ultima analisi, contribuire a migliorare i risultati dei pazienti. Modelli di astrocitoma correnti comprendono stabilite linee cellulari umane, paziente derivante xenotrapianti (PDX), normali astrociti umani geneticamente modificati e cellule staminali neurali (NSC), e topi geneticamente ingegnerizzati (GEM) 10-14. Abbiamo sviluppato una alternativa, GEM non germinali (NGEM) modello 15 che utilizza cellule cerebrali primari – astrociti corticali e NSC – raccolti da GEM ospitare diverse combinazioni di alleli floxed oncogeni. L'obiettivo era quello di generare modelli di astrocitoma con cellule geneticamente definite che potrebbero essere caratterizzati fenotipicamente sia in vitro che in vivo e potenzialmente utilizzabili per lo sviluppo di farmaci in preclinico itopi mmune-competenti.
Linee cellulari umane Fondata sono il modello più comunemente usato di astrocitoma patogenesi e la risposta ai farmaci in vitro e in vivo. Essi sono tecnicamente semplice, ampiamente disponibile, e hanno definito cinetica e cancerogenicità su ortotopico xenotrapianto in topi immunodeficienti 10,11,16-18 . I loro svantaggi includono l'incapacità di generare linee cellulari stabilizzate da astrocitomi di basso grado, limitando studio solo per astrocitoma di alta qualità; mancanza di una cella definita di origine; la presenza di anomalie genomiche complesse, spesso con profili genomici che si differenziano notevolmente dal campione del paziente originale; e suscettibilità fenotipica e genotipica deriva durante la cultura di serie nel siero 11,17,19-22. Le conseguenze fenotipiche delle singole mutazioni oncogene in linee cellulari GBM umani stabiliti possono essere mascherati dalla moltitudine di anomalie che sono effettivamente presenti, che spesso preclude elucidation delle conseguenze dirette genotipo-fenotipo.
PDX sono generati attraverso il passaggio sottocutanea di cellule di astrocitoma-isolati di pazienti in topi immunodeficienti o attraverso la loro cultura come sferoidi non aderenti a definito, terreno privo di siero prima dell'iniezione ortotopico nel cervello di topi immunodeficienti 12,23. PDX mantenere più accuratamente il paesaggio genomico di astrocitoma umano, ma simile a linee cellulari umane stabilite, l'effetto fenotipico di singole mutazioni oncogene può essere mascherato a causa della loro complessità genomica 19,24. Per definire le conseguenze fenotipiche di specifiche mutazioni oncogene, in particolare in risposta alle nuove terapie, i pannelli di linee cellulari umane stabiliti o PDX sono spesso utilizzati per stabilire correlazioni genotipo-fenotipo, mostrare generalizzabilità, e ridurre al minimo la probabilità di effetti specifiche della linea di cellule. Mentre PDX ricapitolare con precisione le caratteristiche istopatologiche di astrocitoma umano, incLuding invasione, xenotrapianti ortotopici di linee cellulari umane stabiliti in genere non 21,23,25. Inoltre, normali astrociti umani e NSC sono stati geneticamente ingegnerizzato con mutazioni oncogene definite per modellare astrocitoma tumorigenesi in vitro e in vivo 13,14,26. Queste cellule non hanno la complessità genomica delle linee cellulari umane consolidate e PDX e ricapitolano accuratamente istopatologia astrocitoma umano, ma richiedono xenotrapianto nei roditori immunodeficienti in vivo. Poiché tutti i modelli cellulari umani richiedono host roditori immunodeficienti per evitare immuno-mediata rifiuto xenotrapianto, questi modelli non riescono a ricapitolare le interazioni tumore-stroma nativi di un sistema singeniche e mancano di un sistema immunitario intatto, limitando indagine preclinica di stroma-mirata e immuno-modulazione terapie 10,11.
GEM permesso di esame delle conseguenze fenotipiche di combinazioni predeterminate di muta oncogenozioni in vivo durante la tumorigenesi in situ. Considerando che la GEM non-condizionale hanno mutazioni all'interno di tutti i tessuti durante lo sviluppo, GEM condizionale hanno floxed alleli oncogeni che consentono il targeting di mutazioni limitando ricombinazione Cre-mediata di specifici tipi cellulari attraverso l'uso di specifici del tipo di cellule promotori 10,11,15,18. Condizionale astrocitoma GEM sono stati utilizzati per chiarire i ruoli funzionali di mutazioni in oncogeni tipi cellulari distinti all'interno di un cervello intatto 11. L'utilità di preclinico in situ gliomagenesis usando GEM condizionale è limitato da una serie di fattori, tra cui 1) la mancanza di una correlazione in vitro, 2) la difficoltà nel generare grandi coorti di topi con genotipi complessi, 3) tempi di latenza delle nello sviluppo del tumore in situ , 4) e stocastico progressione tumorale. Perché in situ tumorigenesi manca un modello corrispondente in vitro, test anti-droga in vitro non può essere eseguita wesima modelli GEM condizionali convenzionali. A differenza di altri tipi di tumore, modelli GEM condizionali di astrocitoma sono raramente indotti da singole mutazioni oncogeniche 11. Pertanto, i regimi di allevamento complessi sono necessari per generare GEM condizionale con più mutazioni oncogene. Inoltre, astrocitoma iniziazione si verifica con penetranza variabile, dopo un lungo periodo di latenza in questi modelli, mentre la progressione di astrocitomi di alto grado si verifica in genere in modo non uniforme, stocastico modo e dà infine origine a tumori con complessi paesaggi genomiche e cinetica di crescita rapida 27, 28. La penetranza variabile e la natura stocastica della progressione maligna nei modelli GEM condizionale richiede che i singoli topi proiettati da radiografie per rilevare la presenza e la posizione di astrocitomi di alto grado prima del loro arruolamento negli studi preclinici di droga. Nel loro insieme, queste limitazioni ostacolano la generazione e la sperimentazione di grandi coorti di GEM condizionale necessario per prtest eClinical droga.
Il sistema GEM RCAS-TVA, che utilizza retrovirali aviaria (RCA) vettori per infettare GEM ingegnerizzato per esprimere il recettore virale (TVA) su specifici tipi di cellule neurali, è stato ampiamente utilizzato per modellare astrocitoma tumorigenesi 11. In contrasto con GEM condizionale, questo sistema modello permette l'introduzione di mutazioni multiple oncogeni in tipi specifici di cellule, senza la necessità di sistemi di allevamento complessi. Tuttavia, è limitato da penetranza variabile, il requisito per dividere attivamente le cellule per ottenere l'integrazione virale, e l'inserimento casuale di transgeni nel genoma dell'ospite 29.
GEM (NGEM) Modelli non germinali, che utilizzano le cellule raccolte da GEM, stanno diventando sempre più importanti perché superare molte delle limitazioni degli altri sistemi modello 15. Il ruolo di avvio tipo di cellula e mutazioni co-occorrenti in astrocitoma patogenesi sono difficili da scoraggiareminiera utilizzando stabilito linee cellulari umane GBM o PDX perché derivano da tumori allo stadio terminale che hanno accumulato ampi mutazioni genetiche in tipi cellulari non definiti nel corso della progressione maligna. Al contrario, tutti i tipi di astrocitoma possono essere modellati utilizzando NGEM inducendo definite mutazioni genetiche all'interno di specifici tipi di cellule cerebrali purificate 11,30. Così, l'influenza di mutazioni genetiche specifiche e tipo cellulare su fenotipi cellulari e molecolari può essere determinata in vitro e in vivo. Simile a linee di cellule GBM umani stabiliti, in vitro test iniziale de droga utilizzando NGEM può essere utilizzato per dare priorità farmaci per la sperimentazione in vivo che utilizzano le stesse cellule. Tumorigenesi in vivo può essere determinato da allotrapianto di cellule NGEM ortotopicamente nel cervello dei fratellini singeniche immuno-competente 30. Questi modelli trapianto allogenico ortotopici permettono quindi nei test in vivo non solo convenzionali citotossici unnd terapie mirate, ma immuno-modulante e terapie stroma mirate pure. Infine, il ruolo del microambiente sulla iniziazione tumorale e la progressione può essere determinata confrontando i risultati tra NGEM e modelli GEM convenzionali utilizzando le stesse mutazioni negli stessi tipi cellulari.
Noi e altri abbiamo sviluppato astrocitoma NGEM utilizzando cellule primarie – astrociti, NSC, o cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) – raccolte da GEM 30-34. La logica alla base dello sviluppo di un astrocitoma NGEM era quello di creare un modello per determinare le conseguenze fenotipiche delle mutazioni in oncogeni specifici tipi cellulari che potrebbero essere utilizzati per la sperimentazione preclinica dei farmaci in vitro e in vivo in animali immuno-competenti. Abbiamo raccolto astrociti fenotipicamente WT corticali e NSC da non esprimono Cre, GEM subordinata mantenuto su un 94% C57 / BL6 sfondo> con floxed RB percorso – Rb1 loxP / loxP, o TgGZT121 – e floxed RTK / RAS / PI3K pathway – Nf1 loxP / loxP, Kras G12D, Pten loxP / loxP – geni in varie combinazioni 35-39. Siamo indotti ricombinazione genetica in vitro utilizzando vettori adenovirali codificanti Cre ricombinasi. Perché raccolti astrociti corticali contengono una miscela di tipi di cellule, abbiamo utilizzato vettori Ad5GFAPCre o transgeni oncogeni dominanti, come TgGZT 121 guidato dal promotore GFAP umana, per arricchire di GFAP + astrociti corticali in queste culture. Abbiamo definito le conseguenze fenotipiche della G 1 / S (Rb), MAPK, e mutazioni di PI3K pathway in astrociti corticali e NSC in vitro e in vivo. MAPK e PI3K pathway attivato G1 / S-difettosi astrociti molecolarmente imitato GBM umano proneurale e, a seguito di iniezione ortotopico, tumori formate in una posizione pre-definita con cinetica di crescita uniformi, brevi latenze, e la istopatologiciAL caratteristiche di GBM umano 30. Monitoraggio longitudinale della crescita tumorale in vivo aiuta droga test preclinici attraverso la normalizzazione delle coorti di trattamento e analisi quantitativa della crescita tumorale in risposta al trattamento 40. Abbiamo determinato cinetica di crescita tumorale da parte longitudinale bioluminescenza imaging topi iniettati con luciferasi che esprimono astrociti corticali. Pertanto, astrociti corticali e NSC derivate da GEM condizionale forniscono un sistema modello trattabili per la definizione delle conseguenze funzionali di mutazioni astrocitoma associate e di un sistema di potenziale modello per lo sviluppo di farmaci preclinico.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici per assicurare la corretta raccolta e la cultura di astrociti corticali sono 1) di asportare la corteccia senza prendere il tessuto al di sotto del corpo calloso, 2) per togliere le meningi, 3) per dissociare completamente le cellule, e 4) per arricchire di GFAP + astrociti. Anche se abbiamo usato meccanica (scuotimento) e genetico (limitazione di ricombinazione genetica con un vettore Ad5GFAPCre o l'utilizzo di una trasformazione transgene dominante (TgGZT 121)…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CRM is a Damon Runyon-Genentech Clinical Investigator. This work was supported, in part, by grants to CRM from the Damon Runyon Cancer Research Foundation (CI-45-09), Department of Defense (W81XWH-09-2-0042), and University of North Carolina University Cancer Research Fund (UCRF). The authors wish to thank Daniel Roth for mouse husbandry assistance. The authors also wish to thank Hannah Chae, Carter McCormick, Demi Canoutas, Stephanie Gillette, and Susannah Krom for tissue culture and immunofluorescence assistance.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Invitrogen | 11995065 | DMEM can also be purchased from other suppliers including GIBCOSigma and Cellgro |
| Fetal Bovine Serum, Regular | Cellgro | 35-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-395 | |
| Cartilage Thumb Forceps, Curved | Fisher Scientific | 1631 | |
| Miltex 17-301 Style 1 Jeweler Style Forceps, Fine, 4 | Miltex | 17-301 | |
| Ethanol (200 proof) | Decon Labs | 2710 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 14175-095 | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Invitrogen | 12605-010 | Other Trypsin solutions are also suitable for cortical astrocyte havest and culture |
| CULTURE DISH, 60 x 15 mm | Thomas Scientific | 9380H77 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Adenovirus stock | Gene Transfer Vector Core, U. Iowa | Ad5CMVCre | Store in 5 µl aliquots at -80 C. Hazardous. Use Bsl2 safetyy precautions |
| Sodium sulfate (Na2SO4) | Sigma-Aldrich | 238597 | |
| Potassium sulfate (K2SO4) | Sigma-Aldrich | 221325 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 746495 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| D-(+)- Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Papain | Worthington | LS003127 | |
| L-Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C1276 | |
| Syringe filter (0.22 µm pore size) | Millipore | SLGP033NS | |
| Neurocult proliferation kit, mouse | Stemcell Technologies | 5702 | This kit contains the NeuroCult NSC Basal Medium and NeuroCult NSC supplement needed for NSC culture |
| 0.2% Heparin solution | Stemcell Technologies | 7980 | |
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0261 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | Invitrogen | 14185-052 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| E-64 | Sigma-Aldrich | E3132 | Make 10 mM stock in DMSO, store at -20 °C |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Cell strainer (40 µm pore size) | Corning | 352340 | |
| Stem cell dissociation solution | Stemcell Technologies | 5707 | Alternatively, use gentle enzyme solutions such as Accutase |
| Methyl cellulose 15 cP | Sigma-Aldrich | M7027 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media 2X | Millipore | SLM-202-B | For making 5% methyl cellulose solution |
| 1.7mL Snap Cap Microcentrifuge Tube | Corning | 3620 | |
| Hamilton syringe, 250 µl LT no needle | Fisher Scientific | 14-815-92 | |
| PB600-1 Antigen Dispenser | Hamilton | 83700 | |
| Disposable 18 ga needles | Fisher Scientific | NC9015638 | |
| 27 ga 1/2" luer tip needle | Fisher Scientific | 14-826-48 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC9689910 | |
| Model 900 Stereotaxic frame | Kopf Instruments | ||
| VETBOND | Fisher Scientific | NC9259532 | Tissue adhesive |
| Lidocaine | ShopMedVet | RXLIDO-EPI | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3580 | |
| Anti-Sox2 | Millipore | AB5603 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako | Z0334 | |
| IVIS Kinetic | PerkinElmer | For in vivo imaging | |
| D-Luciferin – K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122796 | For in vivo bioluminescence imaging |
| EdU Imaging Kit | Invitrogen | C10340 | |
| MSCV Luciferase PGK-hygro | Addgene | 18782 |
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