Leukocyter korsa endothelial monolager med hjälp av paracellulära eller transcellulära vägen. Vi utvecklade ett enkelt test för att följa fördelningen av endogena Junktional VE-cadherin och PECAM-1 under leukocyt transendotelial migration under fysiologiska flöde för att skilja mellan de två Transmigration vägar.
Under inflammation, leukocyter lämna cirkulationen och korsa endotelet att bekämpa invaderande patogener i underliggande vävnad. Denna process kallas leukocyter transendotelial migration. Två vägar för leukocyter att korsa endothelial monolager har beskrivits: den paracellulära vägen, det vill säga, genom cell-cell korsningar och transcellulära vägen, det vill säga, genom endotelceller kroppen. Däremot har det varit tekniskt svårt att skilja mellan para- och transcellulär rutt. Vi utvecklade ett enkelt in vitro-analys för att studera fördelningen av endogena VE-cadherin och PECAM-1 under neutrofila transendotelial migration under fysiologiska flödesförhållanden. Före neutrofila perfusion, endotelceller kort behandlades med fluorescensmärkta antikroppar mot VE-cadherin och PECAM-1. Dessa antikroppar har inte interfererar med funktionen av båda proteinerna, såsom bestämdes genom elektrisk cell-substrate impedans kännande och FRAP mätningar. Med hjälp av denna analys, kunde vi följa fördelningen av endogena VE-cadherin och PECAM-1 under transendotelial migration enligt flödesförhållanden och skilja mellan de parametrar och transcellulär vandringsvägar för leukocyter över endotelet.
Effektiv och hårt kontrollerad leukocyt transendotelial migration (TEM) är av central betydelse i fysiologiska processer såsom immunövervakning och akut inflammation. Under vissa patofysiologiska förhållanden, okontrollerad och överdriven TEM observeras vilket resulterar i kroniska inflammatoriska sjukdomar (t.ex. reumatoid artrit, ateroskleros, astma). Även under tumörcellmetastas, är processen för transendotelial migrering av avgörande betydelse för tumörceller att lämna cirkulationen att metastasera 1-3. För att specifikt störa alltför leukocyter eller tumörcells TEM, krävs en detaljerad förståelse av regleringen av denna process.
Det antages att TEM process sker genom olika steg. Nyskapande studier omdömet två decennier sedan av Butcher och Springer, ledde till att flerstegsmodellen som beskriver processen för TEM 4,5. Modellen håller än, även om en viss annonsditionella steg har inkluderats 6. Alon et al. Beskrivna behovet av närvaro av immobiliserade kemokiner på ytan av endotelet 7. Nyligen visade de att endotelet i sig genererar kemokiner som presenteras vid den endothelial apikala ytan 8. Dessutom satte samma grupp fram vikten av flödesförhållanden under TEM 7. Nyligen, kan flera publikationer fokuserade på de två olika rutter leukocyter ta vid slut diapedes etappen av TEM. De kan antingen gå igenom cell-cell junctions, dvs, den paracellulära flyttväg eller passera den endotelceller kroppen, som kallas transcellulära migrationsvägen 9. Carman och kollegor studerade dessa vägar i detalj och kom fram till att leukocyter företrädesvis välja paracellulär migrationsvägen (90%) över transcellulär vägen (10%) när de passerar en navelven endothelial monolager 10.Men när endotelceller från annat ursprung har använts, t.ex. hjärnan eller mikrocirkulation, fler leukocyter använde transcellulär vägen (30%) 11. Den Vestweber gruppen visade nyligen att när de cell-cell junctions var oförmögna att dissociera från varandra genom användning av en knock-i djurmodell, som ersätter endogena VE-cadherin för en VE-cadherin-alfa-catenin chimären var leukocyt TEM helt blockerad 12 . Överraskande, märkte författarna att TEM blockerades i flera, men inte alla, vävnader. Sammantaget dessa eleganta experiment indikerade att leukocyter drog den paracellulära vägen över transcellulär vägen, även om de regulatoriska signaler som utlöser detta beslut är fortfarande okänd.
Även om majoriteten av leukocyter föredrar paracellulär flyttväg, är det fortfarande svårt att skilja mellan de båda vägarna. Utöver det, trots flera studier som fokuserar på den roll som den endotelceller cells junctjoner, dynamiken i dessa korsningar, särskilt junctionala proteinerna VE-cadherin och PECAM-1, under leukocyt korsning är fortfarande under diskussion. Vi utvecklade en relativt enkel analys i vilken dessa kopplingsmolekyler kan övervakas i realtid under leukocyt diapedes under fysiologiska flödesbetingelser med användning av fluorescensmärkta antikroppar. Dessa antikroppar inte störa eller blockera Junktional integritet eller mobilitet av de riktade proteiner. Denna analys ger oss möjlighet att följa dynamiken i junctionala proteiner under processen för paracellulär TEM. Dessutom denna analys kan också skilja mellan de parametrar och transcellulära vandringsvägar.
För detta protokoll är det viktigt att förhindra uppkomsten av luftbubblor i flödeskammare, eftersom detta kommer att leda till cell apoptos och en störd monolager. För att undvika detta vill vi betona att särskilt intresse för steg 4.2 och 4.5, där rören är anslutna till flödeskammaren. Ett annat viktigt steg i protokollet är priming av PMN som hålls vid RT genom att inkubera dem under 15-30 minuter vid 37 ° C före injektion dem till flödeskammaren (steg 4.1). Detta resulterar i priming av leukocyt-integriner, vilket tillåter dem att följa adhesionsmolekyler såsom ICAM-1 eller VCAM-1 på endotel.
Detta protokoll är inte begränsad att studera transmigration av neutrofiler. Även andra leukocyttyper såsom monocyter eller lymfocyter kan användas. Observera att steg 4.1, det vill säga, priming leukocyterna kan skilja mellan leukocyttyper. Dessutom kan andra typer av endotelceller användas. För detta är det fortfarande kritiskatt stimulera endotelceller med lämpliga inflammatoriska stimuli såsom TNF-α eller IL-1β. Om neutrofiler inte svarar i transmigrating, kan man överväga att behandla neutrofiler kort (5 min) med N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-L-fenylalanin (fMLP) peptid 16. Detta kommer att stimulera neutrofiler, särskilt deras integriner, ännu längre, vilket gör dem mer benägna att ansluta sig till endotelet.
Typiskt 1 dyn / cm 2 flödeshastighet används. Denna flödeshastighet mäts i postkapillära venoler, platser där de flesta leukocyter transendotelial migration sker 17. Med användning av de beskrivna flödeskamrarna, är det möjligt att öka flödeshastigheten upp till 10 dyn / cm 2. Det är dock inte lämpligt att öka skjuvning ytterligare. Det kan resultera i oönskat läckage av slangen och att cellerna lossnar från den flödeskammaren.
De resultat som beskrivs i figur 3 indikerar att dessaantikroppar kan användas för att visualisera och studera dynamiken i endotel cell-cell junctions under leukocyt diapedes. Särskilt utöver de befintliga Transmigration analyserna detta protokoll gör det möjligt att diskriminera paracellulär från transcellulär migration under fysiologiska flödesförhållandena i realtid. Eftersom antikropparna färga cell-cell junctions kan man poäng antalet leukocyter som korsar VE-cadherin / PECAM-1-positiva korsningar kontra ej fast VE-cadherin / PECAM-1 platser. På så sätt transcellulär migration kan särskiljas från paracellulär migration.
Det är viktigt att understryka att dessa antikroppar inte stör funktionen hos de proteiner de binder till: den PECAM-1-antikropp som används i denna studie är riktade mot den andra extracellulära domänen. Endotelceller som ströks ut i närvaro av antikroppen visade inte några defekter i spridnings eller bilda ett monoskikt, vilket tyder på att antikroppen åtminstone inteinterferera med homotypiska interaktioner mellan endotelceller. i tillägg till detta, vet båda antikropparna inte försämra förmågan hos neutrofiler att migrera genom den endoteliala monoskiktet. Dessutom är antalet neutrofiler som transmigrera över endothelial monolager i frånvaro eller närvaro av antikropparna inte ändrats (data visas ej). Viktigt ger konfokal laserscanningsmikroskopi oss möjlighet att spela in olika fluorescerande kanaler och DIC samtidigt.
Således gör denna analys studerar dynamiken i VE-cadherin och PECAM-1 samtidigt när en neutrofila korsar endothelial cell-cell korsning och kommer att hjälpa till att förstå varför leukocyter välja en väg över den andra, det vill säga, paracellulär kontra transcellulär.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | |
μ-Slide VI | IBIDI | 80606 | Flow-chamber | |
0.45 μm filter | Whatman/GE Lifesciences | 10462100 | ||
1 mL syringe | BD Plastipak | 300013 | ||
20 mL syringe | BD Discardit II | 366296 | ||
21G needle | BD Microlance | 301155 | ||
Albumin | Sanquin | 15522644 | ||
Ammunium chloride (NH4Cl) | Merck | 1009245000 | ||
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 449709 | ||
EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. & Growth Factors | Lonza | CC-3156 + CC-4176 | media | |
EDTA (Titriplex III) | Merck | 1370041000 | ||
Falcon tubes | Corning Life Sciences | 352096 | ||
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-2MG | FN | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | ||
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ||
In-line Luer Injection port | IBIDI | 10820 | ||
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Merck | 105886 | ||
PECAM-1-ALEXA-647 | BD Pharmingen | 561654 | clone WM59 stock concentration 0.1mg/mL |
|
Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-09 | ||
Phosphate Buffered Saline | Fresenius Kabi Nederland | M090001/01NL | PBS | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | ||
Potassium hydrogen carbonate (KHCO3) | Merck | 1048540500 | ||
Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | ||
Silicone Tygon 3350 tubing | VWR | 228-4331 | tubing | |
Sodium chloride (NaCl) | Calbiochem (Millipore) | 567441 | ||
Syringe pump | Harvard Apparatus | model number 55-5920 | ||
TNFα | Peprotech | 300-01A | tumor necrosis factor | |
trisodium citrate | Merck | 1.06447.5000 | TNC | |
Vacuettes | Greiner, Germany | 980044 | ||
VE-Cadherin-FITC | BD Pharmingen | 560411 | clone 55-7H1 | stock concentration 0.5mg/mL |
Zeiss LSM510 META | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany | |||
Zen Software 2008 | Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany |