Fluorescens Imaging med One-nanometer Noggrannhet (FIONA)

Summary

Enstaka fluoroforer kan lokaliseras med nanometerprecision med hjälp FIONA. Här en sammanfattning av den FIONA teknik rapporteras, och hur man utför FIONA experiment beskrivs.

Abstract

Fluorescens avbildning med en nanometer precision (FIONA) är en enkel men användbar teknik för att lokalisera enskilda fluoroforer med nanometerprecision i xy-planet. Här en sammanfattning av den FIONA teknik redovisas och exempel på forskning som har utförts med användning av FIONA beskrivs kortfattat. Först, hur man ställer in den nödvändiga utrustningen för FIONA experiment, det vill säga en total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM), med information om att rikta optiken, beskrivs. Sen hur man genomför ett enkelt FIONA experiment på lokalisera immobiliserade Cy3-DNA enstaka molekyler med hjälp av lämpliga protokoll, följt av användning av FIONA att mäta 36 nm steget storleken på en enda stympad myosin Va motor märkt med en kvantprick, illustreras. Slutligen är senaste försök att utvidga tillämpningen av FIONA till tjocka prover rapporterades. Det visar sig att, med hjälp av en vattenimmersionsobjektiv och kvantprickar indränkt djupt i sol-geler och kaninögonhornhinnor (>200 | im), lokalisering precision 2-3 nm kan uppnås.

Introduction

Omkring 1882, Ernst Abbe fann att utgången av en synlig ljusmikroskop är ~ λ / 2NA, eller ~ 200 nm (där λ är våglängden och NA är den numeriska aperturen) ^1,2. Därför något föremål som är mindre än detta mått skulle framstå som ett diffraktionsbegränsad plats i ett optiskt mikroskop. Emellertid är det möjligt att bestämma den centrala platsen, dvs placeringen av objektet, med en mycket högre precision ^3. Fluorescens avbildning med en nanometer precision (FIONA) är en enkel men användbar teknik för att lokalisera enskilda fluoroforer med nanometerprecision i xy-planet ^4. Precisionen av lokalisering, _σ μ (dvs standardavvikelsen för medelvärdet), beror på det totala antalet insamlade fotoner, , Där N är fotonräkning, s är standardavvikelsen för den fluorescerande fläck, är enpixelstorleken av avbildningsdetektorn, och b är standardavvikelsen för bakgrunden ^3,4. För en fluorofor avger ~ 10000 fotoner, kan FIONA uppnå ~ 1 nm precision ^4.

FIONA kan användas för att exakt bestämma läget för en stationär sändare, eller en rörlig en (förutsatt bilder kan tas tillräckligt snabbt). FIONA kan appliceras sekventiellt på ramarna i filmen och på så sätt spåra rörelse enda molekyl ^{4 8.} Foto-skyddande reagenser kan vara nödvändiga för att säkerställa att provet inte photodegrade. Vidare kan det fluorescerande objektet i sig vara av vilken storlek, mindre eller större än den diffraktion begrän- t.ex. kan det bestå av en organell (~ 1 mikrometer) med många fluorescerande proteiner utspridda på dess membran. Använda FIONA kan ändå ge en mycket exakt (nanometer) genomsnittet av dess genomsnittliga center-of-massa. Den stora förbättringen i lokaliseringsprecision från FIONA tillåter lösa nanometer skala rörelser över tid. Detta har drivit mikroskopi i den molekylära längdskala ^{4 8.}

Sedan uppfinning, har varianter av FIONA utvecklats. Exempelvis ljusfält avbildning med en nanometer precision (bFIONA) ^9, en liten variant av FIONA, bilder och lokaliserar täta föremål såsom melanosomer vivo (mörka föremål som innehåller pigmentet melanin) i med genomlysning. Dessutom har FIONA använts för att lösa flera färgämnen. Exempelvis enda molekyl högupplösande avbildning med fotoblekning (räka) ^10,11 eller enda molekyl högupplösande colocalization (SHREC) ¹² har utvecklats för att lösa två färgämnen inom omkring 10 nm. (Observera att detta är upplösningen, det vill säga hur exakt man kan säga samma färger från varandra.) På senare tid har FIONA analysen bidragit till lokaliseringsprocessen av vissa superupplösning mikroskopi såsom stokastisk optisk reconstruction mikroskopi (STORM) ^13-15 och fotoaktiverade lokalisering mikroskopi (PALM) ^16, där tillfälliga mörka fluoroforer är glada, och sedan fluorescensen är lokaliserad. Genom att upprepade gånger spännande en ganska låg täthet av färgämnen (mindre än en per diffraktionsbegränsad fläck) och därefter uppsamling av fluorescens, analysera var och en av dem genom FIONA kan en bygga upp en högupplöst karta. Upplösningen är sedan bara begränsad av antalet fotoner varje färgämne ger ut, samt saker som att hålla prov stationära (inklusive t.ex. mikroskop scenen) vid förvärvet.

I detta papper, en sammanfattning av den FIONA Teknik och kortfattat beskriva exempel på forskning som har utförts med hjälp av FIONA rapporteras. Först, hur man ställer in den nödvändiga utrustningen för FIONA experiment, det vill säga en total inre reflektion fluorescensmikroskopi (TIRFM), med information om att rikta optiken, beskrivs. Sen hur mangenomföra en enkel FIONA experiment på lokalisera immobiliserade Cy3-DNA enstaka molekyler med hjälp av lämpliga protokoll, som är avbildad. Efter det, för att användningen av FIONA mäter 36 nm steget storleken på en enda stympad myosin Va motor märkt med en kvantprick presenteras. Myosin Va är en viktig processiv motorprotein som bär cellulära last samtidigt translokera längs aktinfilament. Här en myosin Va konstruera stympad används för att avlägsna domäner irrelevanta steget storlek och med en FLAG tagg läggs till i C-terminalen för att möjliggöra enkel märkning med kvantprickar funktion med Anti-FLAG-antikroppar. Detta experiment sker under lågt ATP att bromsa myosin och tillåta användandet av långa tillräckligt exponeringstider för att få en bra fotonräkning i varje ram. Alla tillräckligt ljusa fluorescerande märkning kan vara substituerade i följande protokoll. Slutligen är senaste insats för att utvidga tillämpningen av FIONA till tjocka prover rapporterades. Som ett proof-of-principle, var kvantprickar blöti sol-geler och kaninögonhornhinnor och sedan avbildas och lokaliseras med hjälp av FIONA. För avbildning, en 60X nedsänkning i vatten mål med NA = 1,2 användes eftersom detta mål har en längre arbetsavstånd än tidigare använda 100X oljeimmersionsobjektiv. För att kompensera förlusten i förstoring i målet, var en extra förstoringslins (3,3X eller 4,0X) insatt i vägen utsläpp. Dessutom epi-fluorescens (ej TIR) mikroskopi behöver användas för att få tillgång djupa regioner i de tjocka prover. Det visas att kvantprickar indränkt djupt i sol-geler och kaninögonhornhinnor (Z> 200 nm) kan lokaliseras med 2-3 nm precision.

Protocol

Etik Uttalande: Hornhinnan vävnad från kaniner samlades i enlighet med University of Illinois Institutional Animal Care och användning riktlinjer. 1. TIRFM Setup OBS: Använd laserskyddsglasögon hela tiden. Se till att alla nödvändiga optiska komponenter som anges i den förteckning över material finns tillgängliga och redo för anpassning. Vid behov använder substitut med likvärdiga funktioner från andra företag. Se till att speglar och li…

Representative Results

Ett typiskt mål-typ TIRFM inställning visas i fig 3. Först yta-immobiliserad Cy3-DNA-provet avbildas. En typisk bild visas i figur 4a. Bilden togs med exponeringstid 0,5 sek, med EM vinst = 50 och CCD känslighet = 12.13 för kameran. Poängen-spread-funktion (PSF) av ett enda Cy3-DNA-molekyl visas i figur 4b (från platsen som anges av pilen i figur 4a), där färgen baren visar omfattningen av pixelintensiteter. Den faktiska fotonräkningar kunde b…

Discussion

FIONA är en teknik för att lokalisera positionen för en fluorescerande sändare (organisk fluorofor eller kvant prick) med nanometerprecision och tidsmässig upplösning ner till 1 ms ^{4 8.} När tillräckligt många fotoner samlas, gör denna teknik för att bestämma positionen för en fluorescerande emitter mycket mer exakt än diffraktionsgränsen (~ 200 nm) och därmed denna teknik öppnar ett sätt att observera vad som inte setts med konventionell / traditionell optisk mikroskopi ^{4 – 8.} Sed…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Double-sided tape	3M	—	~ 75 um thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions	—
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies	—	5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
Matlab	MathWorks	—
Optical table	Newport Corp	—	RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab	—
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10x beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB2-E02, KM200	Quantity: 2
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW