L'imagerie de fluorescence avec un nanomètre Précision (FIONA)

Summary

Fluorophores simples peuvent être localisés avec une précision nanométrique en utilisant FIONA. Voici un résumé de la technique FIONA est rapporté, et comment réaliser des expériences Fiona est décrit.

Abstract

imagerie de fluorescence avec une précision d'un nanomètre (FIONA) est une technique simple mais utile pour localiser fluorophores simples avec une précision nanométrique dans le plan xy. Voici un résumé de la technique FIONA est rapporté et des exemples de recherches qui ont été effectuées en utilisant FIONA sont brièvement décrits. Tout d'abord, comment mettre en place l'équipement nécessaire pour les expériences FIONA, c'est à dire, une microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM), avec plus de détails sur l'alignement de l'optique, est décrit. Alors comment réaliser une expérience FIONA simples sur la localisation de molécules simples Cy3 ADN immobilisé à l'aide des protocoles appropriés, suivis par l'utilisation de FIONA pour mesurer la taille de l'étape 36 nm d'un moteur Va myosine tronqué unique marqué par un point quantique, est illustré. Enfin, l'effort récent pour étendre l'application de FIONA à des échantillons d'épaisseur est rapporté. Il est montré que, en utilisant un objectif à immersion d'eau et les points quantiques trempé profondément dans sol-gels et les cornées l'œil de lapin (>200 um), la précision de localisation de 3.2 nm peut être obtenue.

Introduction

Autour de 1882, Ernst Abbe a constaté que la résolution d'un microscope à lumière visible est d'environ λ / 2NA, ou ~ 200 nm (où λ est la longueur d'onde et NA est l'ouverture numérique) ^1,2. Par conséquent un objet plus petit que cette dimension apparaît comme une tache de diffraction limitée à un microscope optique. Cependant, il est possible de déterminer le centre de la tache, qui est la position de l'objet, avec une précision beaucoup plus élevée ^3. imagerie de fluorescence avec une précision d'un nanomètre (FIONA) est une technique simple mais utile pour localiser fluorophores simples avec une précision nanométrique dans le plan xy ^4. La précision de la localisation, _σ μ (ie, l'erreur-type de la moyenne), dépend du nombre total de photons collectés, , Où N est le nombre de photons, s est l'écart-type de la tache fluorescente, est unla taille de pixel du détecteur de formation d'image, et b est l'écart type de la base ^{de 3,4.} Pour un fluorophore émettant de ~ 10 000 photons, FIONA peut atteindre 1 ~ ⁴ nm précision.

FIONA peut être utilisée pour déterminer avec précision la position d'un émetteur stationnaire, ou un un déplacement (en supposant que les images peuvent être prises assez rapidement). FIONA peut être appliqué séquentiellement aux images du film et donc de suivre le mouvement de la molécule unique ^{4 8.} réactifs photo-protection peuvent être nécessaires pour s'assurer que l'échantillon ne photodégrader pas. En outre, l'objet lui-même fluorescent peut être de n'importe quelle taille, plus petite ou plus grande que la diffraction LIMIT- par exemple, il peut consister en un organite (~ 1 um) avec de nombreuses protéines fluorescentes dispersées sur sa membrane. Utilisation FIONA peut encore donner un très précise (nanomètre) moyenne de sa moyenne centre de masse. La grande amélioration de la précision de localisation par FIONA permet de résoudre nanomemouvements ter-échelle au fil du temps. Cela a poussé la microscopie dans l'échelle de longueur moléculaire ^{du 4 au 8.}

Depuis son invention, des variantes de FIONA ont été développés. Par exemple, l'imagerie à champ lumineux avec une précision d'un nanomètre (bFIONA) ^9, une légère variante de FIONA, images et localise les objets denses tels que les mélanosomes vivo (objets sombres contenant les pigments de mélanine) dans avec la lumière transmise. En outre, FIONA a été utilisée pour résoudre plusieurs colorants. Par exemple, une seule molécule imagerie à haute résolution avec photoblanchiment (crevettes) ^10,11 ou une seule molécule à haute résolution colocalisation (SHREC) ¹² ont été développées pour résoudre deux colorants dans environ 10 nm. (Notez que c'est la résolution, c'est à dire avec quelle précision on peut dire colorants identiques à part.) Plus récemment, l'analyse FIONA a contribué au processus de localisation de certains microscopie de super-résolution comme reco optique stochastiquemicroscopie nstruction (STORM) ^{du 13 au 15} et la localisation microscopie photo-activé (PALM) ^16, dans lequel fluorophores sombres temporaires sont excités, puis la fluorescence est localisée. Par plusieurs reprises excitant assez faible densité de colorants (moins d'un par diffraction de place limité), puis à recueillir la fluorescence, analyse chacun d'eux par FIONA, on peut construire une carte à haute résolution. La résolution est alors seulement limité par le nombre de photons chaque colorant éteint, ainsi que des choses comme le maintien de l'échantillon fixe (y compris, par exemple, la platine du microscope) lors de l'acquisition.

Dans cet article, un résumé de la technique FIONA et décrire brièvement des exemples de recherches qui ont été effectuées à l'aide FIONA est rapporté. Tout d'abord, comment mettre en place l'équipement nécessaire pour les expériences FIONA, c'est à dire, une microscopie de fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM), avec plus de détails sur l'alignement de l'optique, est décrit. Alors commentréaliser une expérience FIONA simples sur la localisation de molécules simples Cy3 ADN immobilisé à l'aide des protocoles appropriés, est illustré. Après cela, l'utilisation de FIONA pour mesurer la taille de pas de 36 nm d'un moteur de myosine Va tronqué unique marqué par un point quantique est présentée. Myosine Va est une protéine essentielle du moteur processive qui transporte des marchandises le long de la translocation cellulaire alors que les filaments d'actine. Voici une myosine Va construire tronquée est utilisée pour supprimer des domaines sans rapport avec la taille de l'étape, et avec une étiquette FLAG ajouté à l'extrémité C-terminale pour permettre la facilité d'étiquetage avec des points quantiques fonctionnalisés avec des anticorps anti-FLAG. Cette expérience est réalisée sous faible ATP pour ralentir la myosine et de permettre l'utilisation de longs temps d'exposition suffisant pour obtenir un bon nombre de photons dans chaque trame. Toute étiquette fluorescente suffisamment lumineuse pourrait être substitué dans le protocole suivant. Enfin, dernier effort d'étendre l'application de FIONA à des échantillons d'épaisseur est rapporté. Comme une preuve de principe, les points quantiques ont été trempésen sol-gel et les cornées l'œil de lapin puis imagé et localisée à l'aide FIONA. Pour l'imagerie, un objectif à immersion 60X d'eau avec NA = 1.2 a été utilisé parce que cet objectif a une distance plus de travail que précédemment utilisé 100X objectif à immersion d'huile. Pour compenser la perte dans le grossissement de l'objectif, une lentille supplémentaire grossissement (3.3X 4.0X ou) a été inséré dans le chemin d'émission. En outre, l'épi-fluorescence (pas TIR) microscopie doit être utilisé pour accéder à des régions profondes dans les échantillons épais. Il est démontré que les points quantiques trempés profonde dans sol-gels et cornées l'œil de lapin (Z> 200 um) peuvent être localisés avec précision 2-3 nm.

Protocol

Déclaration d'éthique: Le tissu de la cornée de lapins ont été recueillis en conformité avec l'Université de l'Illinois institutionnel de protection des animaux et l'utilisation des lignes directrices. Configuration 1 TIRFM REMARQUE: Porter des lunettes de sécurité laser tout le temps. Assurez-vous que tous les composants optiques nécessaires énumérés dans la liste des matériaux sont disponibles et prêts pour l'aligne…

Representative Results

Une configuration typique de type objectif TIRFM est représenté sur la Figure 3. Tout d'abord, l'échantillon Cy3 ADN immobilisé sur la surface a été imagée. Une image typique est représentée sur la figure 4a. L'image a été prise avec le temps d'exposition de 0,5 s, avec un gain de EM = 50 et la sensibilité du CCD = 12.13 pour la caméra. La fonction à répartition de points (PSF) d'une seule molécule d'ADN-Cy3 est représenté sur la figure …

Discussion

FIONA est une technique pour localiser la position d'un émetteur fluorescent (fluorophore organique ou points quantiques) avec une précision nanométrique et une résolution temporelle à 1 ms ^{4 8.} Lorsque suffisamment de photons sont collectés, cette technique permet de déterminer la position d'un émetteur fluorescent beaucoup plus précise que la limite de diffraction (~ 200 nm) et donc cette technique ouvre la voie à observer ce qui n'a pas été vu en microscopie optique classique / trad…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Double-sided tape	3M	—	~ 75 um thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions	—
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies	—	5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
Matlab	MathWorks	—
Optical table	Newport Corp	—	RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab	—
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10x beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB2-E02, KM200	Quantity: 2
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW