RNA Isolasjon fra Mouse Pancreas: En Ribonuclease rike Tissue
Summary
We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.
Abstract
Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.
Introduction
Isolering av RNA med høy integritet er nødvendig for rutinemessig molekylærbiologiske eksperimenter som nordblotting 9, QRT-PCR en eller genuttrykk profilering fem. De fleste moderne fremgangsmåter for RNA-isolering er basert på modifikasjoner av guanidin thiocyanate protokoller 2, 3.. Guanidine tiocyanat er en sterk protein denaturant, og vil effektivt forstyrrer aktiviteten av ribonuklease under de fleste forhold. Den populære metode for Chomczynski and Sacchi 3 kombinerte fenol til guanidin-tiocyanat lysis-løsning, noe som reduserer isolasjons gang til om lag 4 hr. Mange kommersielt tilgjengelige RNA ekstraksjon reagenser er basert på den Chomczynski og Sacchi metode tre.
Ribonuklease rike vev som human eller mus pancreas presenterer en ytterligere utfordring for å isolere RNA. Mus bukspyttkjertelen kan inneholde opp til 75 mg av ribonuklease 6 noen som vil bli utgitt During forstyrrelse av pankreatisk vev resulterer i vev autolyse. Modifikasjoner av guanidin-thiocyanate protokoller har blitt brukt for å isolere RNA fra bukspyttkjertelen med høy integritet 2, 4, 7, 10. Infusjon av RNA stabilisering reagens i mus pancreas lettere isolering av RNA med høy integritet 4, 7, 10, men infusjon løsninger inn bukspyttkjertelen krever stor dyktighet, kan kreve spesialiserte instrumenter som en dissekere mikroskop og forstyrre vevsarkitektur under prosedyren kan føre til cellelyse. Perfusert vev med RNA stabilisering reagens kan forstyrre andre programmer, inkludert protein isolasjon og histologiske flekker. Videre er denne teknikk ikke er egnet for å isolere RNA fra human bukspyttkjertel. Andre protokoller krever utarbeidelse av konkrete løsninger av utprøver to.
Vi rapporterer en protokoll for å isolere RNA med høy integritet fra mus bukspyttkjertelen. The-protokollen bruker elementer av tidligere publiserte metoder og er i stor grad basert på standard fenol / gua-nidin thiocyanate basert Lysereagens protokoller. Det krever ikke utarbeidelse av spesialiserte løsninger heller ikke det krever tilførsel av reagenser i bukspyttkjertelen. Kritiske fremgangsmåte for vellykket RNA isolasjon omfatter et høyt fenol / guanidin-baserte lyse-reagens til vev-forhold, å fjerne ufordøyd vev før faseseparasjon og inkludering av en ribonuklease inhibitor til det resulterende RNA-løsningen. Ved hjelp av disse og andre modifikasjoner, vi vanligvis isolere RNA med RIN større enn 7 til å bli brukt for rutine genekspresjonsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolere RNA fra vev som er ribonuklease rik representerer en stor utfordring for molekylærbiologi eksperimenter. Forskjellige reagenser og kit er kommersielt tilgjengelig som primært er basert på fenol-guanidin-tiocyanat-metoden av RNA ekstraksjon. Guanidin-tiocyanat denatures protein og dermed reduserer aktiviteten av ribonuklease. Men selve omfanget av ribonuklease i bukspyttkjertelen krever ytterligere endringer i standardprotokoller av RNA isolering. En protokoll som er rapportert her som er basert på standard g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo og Satyanarayana Rachagani for nyttige kommentarer, forslag og deling av sine protokoller. Dette arbeidet ble støttet av stipend U01CA111294 og en Idea Development Award fra Ohio State University egenutført Research Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Power Gen 500 | Fisher Scientific | 14-261-03 | Homogenizer |
| 5424R | Eppendorf | Refrigerated microcentifuge | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596018 | Lysis reagent |
| Student Vannas spring scissors | Fisher | 91500-09 | use to cut pancreas from attached tissues |
| Surgical scissors, 6 inch | Fisher | 08-951-20 | use to cut scin of mouse |
| Blunt end forceps | Fisher | 1381239 | use to hold pancreas while dissecting |
| Isoflurane USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | Anesthetic |
| Rnase out (40 U/µl) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | General Rnase inactivator |
| HPLC grade water | Fisher | W5-4 | For washing homogenizer blades |
| Molecular Biology grade water | Hyclone | SH30538.03 | Elution of RNA |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Purification Kit |
| 2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Falcon | 352099 | |
| 70% ethanol | Fisher | ||
| 100% ethanol | Fisher | ||
| 200 ul pipet tips | Rainin | GPL200F | For cleaning homogenizer blades |
| Chloroform | Fisher | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | Spectrophotometer |
| Bioanalyzer | Agilent | Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity | |
| RNAlater | Ambion | RNA Stabilization Reagent | |
| RNeasy spin columns | Qiagen | spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit | |
| Mice | Chales River | strain C57BL/6 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
| Mice | Jackson Lab | strain 129 | Their age ranged from 4 to 12 months. |
References
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochimie. 18, 5294-5299 (1979).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas. Biotechniques. 52, 332-334 (2012).
- Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum. Science. 283, 83-87 (1999).
- Lenstra, J. A., Beintema, J. J. The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases. European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).
- Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas. Biotechniques. 40, 617-621 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. . RNA A Laboratory Manual. , (2011).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).
