מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.
תרומת וידאו ומאמר זה נותנת תיאור מקיף של microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. טכניקת transfection המסוימת הזה לתאי עכבר אשכים מאפשרת המחקר של תהליכים ייחודיים ביצירת תאי זרע.
הפרוטוקול הבא מתמקד בtransfection של תאי עכבר אשכים עם בונה פלסמיד. באופן ספציפי, אנו משמשים וקטור הכתב pEGFP-C1, המבטא משופר חלבון ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 לבטא חלבון אדום ניאון (DsRed2). שני גני הכתב המקודדים היו תחת שליטתו של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV).
לביצוע העברת גנים לתוך אשכים עכבר, בונה פלסמיד הכתב מוזרקות לתוך אשכים של עכברים חיים. לשם כך, האשכים של בעלי חיים מורדמים חשופים והאתר של microinjection מוכן. המקום המועדף שלנו שלהזרקה היא צינור efferent, עם אשך ךטה" מחובר סופו של דבר כדרך תחבורה האנטומי של תאי הזרע בין האשך ויותרת האשך. בדרך זו, המילוי של אבוביות הזרע לאחר microinjection מנוהל מצוין ומבוקר בשל השימוש בפתרוני DNA מוכתם. לאחר התבוננות מילוי מספק של האשך על ידי מבנה אבובית הצבעוני שלה, האיבר electroporated. זה מאפשר ההעברה של פתרון דנ"א לתוך תאי האשכים. בעקבות 3 ימים של דגירה, האשכים מוסרים ונחקרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק או אדום, הממחישים את ההצלחה transfection.
באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק להעברת דנ"א או RNA- בונה לאשך עכבר חיים כדי (מעל) להביע או להפיל את הגנים, להקל בניתוח תפקוד גן vivo. יתר על כן, הוא מתאים ללימוד מושגי כתב או regula גן המשועראלמנטי טורים. לפיכך, היתרונות העיקריים של טכניקת electroporation הם ביצועים מהירים בשילוב עם מאמץ נמוך, כמו גם הציוד הטכני המתון וכישורים הנדרשים בהשוואה לטכניקות חלופיות.
יצירת תאי זרע של יונקים נחשב לתהליך מתוחכם של תאי גזע עצמי חידוש ברציפות עוברים מיטוזה, מיוזה ובידול על מנת להתפתח לתאי זרע הפלואידים בוגרים. שינויים מורפולוגיים אלה בניצוחו של תאים מסוגים שונים ולמרות ניסיונות עמוקים, זה עדיין בלתי אפשרי לחקות את התהליכים הללו בתא התרבות 1,2. לפיכך, מחקר על יצירת תאי זרע עד עכשיו מסתמך על אורגניזמים חיים כמודלים in vivo. באופן כללי, מחקרי תפקוד הגן מבוססים בדרך כלל על בעלי חיים מהונדסים. עם זאת, יצירה והשמירה של מודל חיה מסוג זה היא זמן רב, עלות אינטנסיבית ומורכבת למדי. זה מיוחס לתהליך הרבייה הארוך הנדרש ליצירת ושמירה על transgene לאורך הדורות. בנוסף, המניפולציה הגנטית של האורגניזם כולו על ידי הגישה המהונדס או נוק אאוט הוא נוטה לגרום לליקויים פיסיולוגיים כאשר מיקוד גרםenes עם פונקציות חיוניות באזורים רבים, למשל, מחוץ לאשך או מערכתי.
יתר על כן, כמה שיטות transfection חולפות קשורות עם כמה חסרונות קריטיים. לדוגמא, חסרונות אופייניים להעברת גנים בתיווך וירוס הם הפרובוקציה האפשרית של immunoreactions ותקנות בטיחות נוספות, ואילו lipofection 3 וmicroparticle הפגזה 4 עלולה לגרום נזק לרקמות ומוגבלות לעומק תא מסוים ליעילות transfection מספיק.
בניגוד לכך, electroporation (EP) כדרך נוספת נפוצה של transfection החולף נראה, להוות טכניקה מבטיחה למאפשר בtransfection vivo וin vivo ניתוח גנטי עולה בקנה אחד. באופן כללי, EP נקרא תופעה דינמית שתלוי במתח הטרנסממברני מקומי עם נקבוביות בתיווך כתוצאה מכך בתוך ננו שניות. t פערים אלה יכולים להישמר במשך אלפיות השניה, מספיקo להעניק גישה לDNA, RNA או מולקולות קטנות 5. כאשר המתח שיושם הוא גבוה מדי, האופי בדרך כלל החולף של EP הוא נוטרל עקב ייצור חום ואינדוקציה של permeabilization המקיף מדי עם נזק בלתי הפיך הסוגר של התא 5.
כאן, אנו מראים כי electroporation הוא מערכת transfection יעילה וחסכונית שהוא מסוגל להיות מנוצל לשינוי אשך גנטי כדי להבהיר מאפיינים גנטיים אשכי in vivo. מאמר זה עוסק הכנת פלסמיד, microinjection באמצעות צינור efferent וelectroporation הבא של אשך עכבר. הליך זה יכול להיות האמצעי של בחירה כדי להשיג transfection מהיר, ספציפי והיעיל של אבוביות זרע של אשך עכבר in vivo כדי לחקור תהליכים של יצירת תאי זרע.
מחקר בתחום הביולוגיה של רבייה, במיוחד בתחום של פריון ויצירת תאי זרע באופן בלתי נמנע זכר מסתמך על אורגניזמים חיים. על מנת לבחון תפקוד אשכים, אין תרבית תאים מתאימה / מערכת במבחנה כבר נקבעה מסוגל משקף את כל השינויים מורפולוגיים המכריעים מspermatogonium דיפלואידי …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים בירגיט Westernstroeer של המרכז של רפואת הפוריות והאנדרולוגי באוניברסיטת מינסטר להוראת microinjection האשכים. חוץ מזה, אנחנו מודים לאורסולה Antkewitz ופטרה Reckling לקבלת סיוע טכני. אנו מודים לקרן המחקר הגרמנית (DFG) לתמיכה בעבודה זו (WE2458 / 10-1).
centrifuge |
Sigma | 1-15 PK | |
spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder |
|
fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
surgical suture | Catgut 00 | Catgut Markenkirchen |
|
syringe, with 30G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
10x PBS, pH 7.4 | Carl Roth | 3957.1 | NaCl [1.37 M] |
6781.1 | KCl [27 mM] | ||
T106.2 | Na2HPO4+2H2O [100 mM] | ||
3904.1 | KH2PO4 [18 mM] | ||
10% Ketamin | Serum Werk Bernburg |
Urotamin | mix in a rate 1:1 |
2% Xylazin | Serum Werk Bernburg |
Xylazin | |
Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
vet ointment | S&K Pharma GmbH |
Kerato Biciron 5% Augensalbe |
or similar to prevent dryness of eyes |
To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 |