Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.
Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.
عملية بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME) تعتمد عند وصول توقيت جيد لعناصر كثيرة من الآلات التقامي بوساطة بالكلاذرين لجمع البضائع والتلاعب غشاء البلازما إلى الحويصلات 1-3. يبدأ CME من تشويه الغشاء والبضائع محول البروتينات التي تأتي معا في مواقع الوليدة من الإلتقام 1. هذه البروتينات تجنيد بالكلاذرين البروتين معطف، والتي تجمع إلى بنية تشبه القفص الذي يشكل حفرة المغلفة بالكلاذرين (CCP) 4. مرة واحدة يتم تجميعها في CCP بالكامل في شكل كروي، انفصال الغشاء، في المقام الأول من خلال عمل GTPase كبير، dynamin، يولد حويصلات المغلفة بالكلاذرين مجانية (CCVs) 5،6. استيعاب هذا يؤدي التفكيك السريع للمعطف بالكلاذرين، مما يسمح المكونات ليتم إعادة استخدامها لجولات متعددة من التعليم الطبي المستمر.
تم اكتشاف الجذور وتوصيف البروتينات المشاركة في التعليم الطبي المستمر في bioch التقليديemical، الوراثية، وتقنيات الفحص المجهري 4-6،8. وقد أوضحت هذه المقايسات أدوار ونقاط التفاعل بين هذه المكونات التقامي. على الرغم من المفيد جدا لتحديد المكونات الأساسية للماكينات الاتجار، هذه المقايسات محدودة للغاية في الاستيلاء على السلوك الديناميكي مكونات CME أو تركيز البضائع. هذا هو الحد الحرج، منذ تحركها CME من قبل الجمعية فشلت مجموعات من وحدات البروتين في خطوات محددة، ومنذ التغيرات الصغيرة في ديناميات الأحداث التقامي الفردية يمكن أن تكون له عواقب تراكمية كبيرة على الإلتقام. وعلاوة على ذلك، فإن البيانات الأخيرة تشير إلى أن نقط التحكم الحرجة الفردية قد تختلف سواء في تكوين والسلوك، مما يشير إلى أن التنظيم الفسيولوجي لهذه العملية هو غاية مكانيا وزمانيا مقيدة 9-14. تصور الأحداث التقامي الفردية، وبالتالي، لا بد أن نفهم لماذا هناك بروتينات زائدة المتعددة التي ينطوي عليها ب CME وكيف يمكن التحكم هذه البروتيناتإشارات الفسيولوجية ذ لتنظيم استيعاب البضائع.
نحن هنا وصف استخدام التفكير إجمالي الداخلية مضان المجهري (TIRFM) لمراقبة CME على مستوى ديناميات نقط التحكم الحرجة الفردية في الخلايا الحية. TIRFM تعتمد على الفرق في معامل الانكسار بين ساترة الزجاج والبيئة السوائل من الخلايا 15،16. عندما يتم توجيه ضوء الإثارة تجاه الخلايا في أكثر من زاوية حرجة، وينعكس داخليا، وخلق موجة زائل التي تحافظ على حقل رقيقة من الإضاءة تمتد حوالي 100 نانومتر فوق ساترة. وهذا يضمن أن فقط جزيئات الفلورسنت في هذا المجال الضيق متحمسون. عمليا، هذا يسمح الإثارة من جزيئات الفلورسنت على أو بالقرب من غشاء البلازما، ويقلل من مضان من الأجزاء الداخلية للخلية. هذا يوفر أعلى بكثير نسبة الإشارة إلى الضوضاء وض محور قرار لتصور الأحداث في غشاء البلازما، وشاركmpared إلى طرق أكثر شيوعا مثل epifluorescence التقليدية أو متحد البؤر المجهري مضان. وصفنا أيضا، في أحد التمهيدية والمستوى العملي، واستخدام صورة منصة التحليل تستخدم عادة لتحليل وquantitate معالم شكلية بسيطة وديناميات الأحداث الفردية التقامي البضائع.
نحن هنا وصف استخدام TIRFM لتصور بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME) على مستوى الأفراد نقط التحكم الحرجة في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي. CME هو الحدث السريع والديناميكي للغاية بوساطة الأثر التراكمي لأحداث فردية العديد مكانيا وزمانيا منفصلة. معظم المقايسات التي يتم استخدا?…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. C. Szalinski, H. Teng, and M. Bruchez for help with Imaris, R. Vistein, and D. Shiwarski for technical help and advice, and Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers for reagents and helpful discussion. Funding provided by T32 grant NS007433 to SLB and NIH DA024698 and DA036086 to MAP.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
25 millimeter coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
Corning cell culture treated flasks, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
[D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |