Músculo liso da bexiga Faixa Contractility como um método para avaliar do trato urinário inferior Farmacologia

Summary

Este manuscrito apresenta um simples, mas poderoso, método in vitro para a avaliação da contratilidade do músculo liso em resposta a agentes farmacológicos ou estimulação do nervo. As principais aplicações são triagem de drogas e fisiologia do tecido entendimento, farmacologia e patologia.

Abstract

Descreve-se um método in vitro para medir a contractilidade do músculo liso da bexiga, e a sua utilização para a investigação de propriedades fisiológicas e farmacológicas do músculo liso, assim como as alterações induzidas pela patologia. Este método proporciona informação crítica para compreender a função da bexiga ao superar grandes dificuldades metodológicas encontradas em experimentos in vivo, tais como as manipulações cirúrgicas e farmacológicas que afetam a estabilidade ea sobrevivência das preparações, o uso de tecidos humanos, e / ou o uso de produtos químicos caros. Também proporciona uma forma a investigar as propriedades de cada componente da bexiga (por exemplo, músculo liso, mucosa, nervos) em condições saudáveis ​​e patológicas.

A bexiga é removida a partir de um animal anestesiado, colocada em solução de Krebs e cortada em tiras. As tiras são colocadas dentro de uma câmara cheia com solução de Krebs quente. Uma das extremidades é conectada a um tenso isométrican transdutor para medir a força de contracção, a outra extremidade está ligada a uma haste fixa. O tecido é estimulado pela adição de compostos diretamente para o banho ou por campo de eletrodos de estimulação elétrica que ativam os nervos, semelhante a provocar contrações da bexiga in vivo. Nós demonstramos a utilização deste método para avaliar a contractilidade do músculo liso espontânea durante o desenvolvimento e depois de uma lesão da medula espinal experimental, a natureza da neurotransmissão (transmissores e receptores envolvidos), os factores envolvidos na modulação da actividade do músculo liso, o papel dos componentes individuais da bexiga, e as espécies e as diferenças de órgãos em resposta a agentes farmacológicos. Além disso, poderia ser utilizada para investigar as vias intracelulares envolvidas na contracção e / ou relaxamento do músculo liso, drogas relações estrutura-actividade e da avaliação da libertação do transmissor.

O método in vitro a contractilidade do músculo liso tem sido usado extensivamente for mais de 50 anos, e forneceu dados que contribuíram significativamente para a nossa compreensão da função da bexiga, bem como para o desenvolvimento farmacêutico de compostos actualmente utilizados clinicamente para o controle da bexiga.

Introduction

O músculo liso da bexiga relaxa para permitir o armazenamento da urina, e os contratos para provocar a eliminação de urina. Relaxamento é mediada por propriedades intrínsecas do músculo liso e pela liberação tônica de norepinefrina (NE) dos nervos simpáticos, que ativa os receptores adrenérgicos beta (β ₃ AR em humanos) no detrusor. Anulação é conseguido através da inibição da entrada simpático e ativando os nervos parassimpáticos que liberam acetilcolina / ATP para contrair o músculo liso da bexiga ^1. Diversas condições patológicas, incluindo cérebro e / ou lesão da medula espinhal, doenças neurodegenerativas, diabetes, obstrução da saída da bexiga ou cistite intersticial, pode alterar profundamente a função da bexiga, com grave impacto na qualidade de vida do paciente ^2. Estas condições de alterar a contractilidade do músculo liso por afectar um ou mais componentes da bexiga: a musculatura lisa, o aferente ou nervos eferentes e / ou omucosa.

Vários in vivo e em métodos in vitro para estudar a função da bexiga têm sido desenvolvidos. In vivo, a cistometria é a medida primária da função da bexiga. Embora isto seja uma preparação intacta que permite a recolha de informação em condições próximas das condições fisiológicas, há um número de circunstâncias, em que é preferido o uso de tiras de músculo liso. Estes incluem situações em que as manipulações cirúrgicas e / ou farmacológicos que afectam a sobrevivência e estabilidade da preparação, in vivo, ou quando os estudos requerem a utilização de tecido humano ou de produtos químicos caros. Este método também facilita o exame dos efeitos de drogas, a idade e patologia em cada componente da bexiga, do músculo liso, ou seja, a mucosa, nervos aferentes e eferentes.

Tiras de bexiga têm sido utilizados ao longo dos anos por muitos grupos para responder a uma série de questões científicas. Eles foram usados ​​para evamudanças luate em atividade espontânea miogênica induzida pela patologia. Acredita-se que esta atividade para contribuir para a urgência e frequência sintomas de bexiga hiperativa (OAB), e é, portanto, um alvo para drogas que está sendo desenvolvido para OAB ^3-9. Tiras de bexiga também foram utilizados para investigar fatores miogênicos e neuronais que modulam tônus ​​da musculatura lisa, com o objetivo de descobrir os canais iônicos e / ou receptores e / ou vias intracelulares que poderiam ser direcionados para induzir qualquer relaxamento ou contração da musculatura lisa ^{3,10- 13.} Outros estudos focaram-se na natureza da neurotransmissão, incluindo os transmissores e receptores envolvidos e as mudanças induzidas pela patologia ^14,15. Além disso, o método tem sido usado para as comparações entre os tecidos a partir de diferentes espécies de ^{16 a 18,} entre os órgãos de ^19-21, e a avaliação das relações estrutura-actividade de drogas ^22-24. Uma extensão deste método tem sido usado para MEASURÊ O efeito de drogas na liberação do transmissor de nervos eferentes ^25. Além disso, uma variedade de tecidos (bexiga, uretra, tracto gastrintestinal, GI), colhidas a partir de animais ou seres humanos (a partir de cirurgias ou tecido do dador de órgãos aprovados para a pesquisa) e a partir de uma variedade de modelos animais, incluindo lesão da medula espinal (SCI), obstrução da saída da bexiga (BOO), ou cistite intersticial (IC) pode ser investigada usando esta técnica.

Neste trabalho, ilustramos o uso deste método, juntamente com protocolos experimentais necessárias, para solucionar diversas questões científicas mencionadas acima.

Protocol

Todos os procedimentos aqui descritos são aprovados pelo comitê IACUC na Universidade de Pittsburgh. 1. Solutions Preparar a solução de Krebs de acordo com a receita. Composição em mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl2 1,9, MgSO4 1,2, NaHCO3 24,9, KH 2 PO 4 1,2, dextrose 11,7. Arejar Krebs com 95% de O2, 5% de CO 2 e coloque-o em um banho de 37 ° C a água para ser usado durante todo o experimento…

Representative Results

Espontâneo Atividade Miogênica Atividade miogênica espontâneo é uma importante característica do músculo liso que sofre alterações com o desenvolvimento pós-natal 6-9 e patologia (por exemplo, SCI, BOO) 3-5. Porque se acredita que essa atividade contribui para os sintomas de bexiga hiperativa (OAB) 2, uma avaliação de receptores, vias intracelulares e agentes farmacológicos que modulam, é de grande interesse para o dese…

Discussion

Neste artigo descrevemos um simples método in vitro contratilidade do músculo liso que pode ser usada para abordar uma série de questões científicas importantes relacionados à fisiologia e patologia da bexiga, bem como auxiliando na descoberta de novos medicamentos para tratar disfunções de bexiga. Ilustramos o uso deste método para avaliar as propriedades de desenvolvimento, patológicos e farmacológicos da contractilidade do músculo liso da bexiga (Figuras 2-4), modulação da neur…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and surgical instruments
sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:                             Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride	Sigma                                    Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions