Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto
Summary
El bulbo olfativo accesorio ratón (AOB) ha sido difícil de estudiar en el contexto de la codificación sensorial. Este sentido, demuestran una disección que produce un vivo preparación ex en el que las neuronas AOB permanecen funcionalmente conectados a sus entradas de periferia, facilitando la investigación sobre el procesamiento de información de las feromonas del ratón y kairomones.
Abstract
El sistema olfativo accesorio ratón (AOS) es una vía sensorial especializado para detectar olores volátiles sociales, feromonas, y kairomones. El primer circuito de los nervios en la vía de AOS, llamado el bulbo olfativo accesorio (AOB), juega un papel importante en el establecimiento de comportamientos sexuales típicos como la agresión territorial y el apareamiento. Este (<1 mm 3) Circuito pequeño posee la capacidad de distinguir los estados de comportamiento únicas, tales como el sexo, la tensión y el estrés a partir de pistas quimiosensoriales en las secreciones y excreciones de sus congéneres. Mientras que la organización compacta de este sistema presenta oportunidades únicas para el registro de grandes porciones del circuito a la vez, la investigación de procesamiento sensorial en el AOB sigue siendo un reto, en gran parte debido a su ubicación experimentalmente desventajosa en el cerebro. Este sentido, demuestran una disección de múltiples etapas que elimina la AOB intacta dentro de un solo hemisferio del cráneo del ratón anterior, dejando a conectariones a ambos los vomeronasal neuronas sensoriales periféricas (VSNS) y circuitos neuronales locales intactas. El procedimiento expone la superficie AOB para dirigir la inspección visual, facilitando electrofisiológico y grabaciones ópticas de elementos de circuito AOB en ausencia de anestésicos. Al insertar una cánula delgada en el órgano vomeronasal (OVN), que alberga los VSNs, se puede exponer directamente a la periferia a los olores y feromonas sociales durante la grabación de la actividad aguas abajo en el AOB. Este procedimiento permite a las investigaciones controladas en el procesamiento de información del AM, que puede arrojar luz sobre los mecanismos que vinculan la exposición de feromonas a cambios en el comportamiento.
Introduction
El procesamiento sensorial en el cerebro de los mamíferos normalmente abarca múltiples circuitos neuronales conectadas recíprocamente-, cada uno de los cuales extrae los rasgos particulares de la información sensorial. En las vías sensoriales, procesamiento de la información temprana es vital para la percepción y el comportamiento normal. En el sistema olfativo accesorio (AOS), el bulbo olfativo accesorio (AOB) es el circuito de los nervios principales que une la periferia sensorial a las estructuras posteriores que determinan el equilibrio hormonal 1,2, la agresión 3, 4 y la excitación. Como tal, el procesamiento de la información dentro de este circuito está fuertemente ligada a los cambios en el comportamiento animal.
El bulbo olfativo accesorio se encuentra en ratones y ratas en la cara dorsal / caudal / posterior del bulbo olfatorio principal (MOB) debajo de la densa, vascularizado sinusal rinal. La AOB recibe inervación aferente de los axones de las neuronas sensoriales vomeronasal periférica (VSNS) que residen en el órgano vomeronasal (OVN), un Small tubo y sin salida en el hocico anterior justo por encima del paladar blando. Estos axones atraviesan la delicada hoja de tejido septal en el límite medial de los pasajes nasales. Varios estudios han investigado AOB respuestas neuronales a las fuentes de olores adicionales opcionales (tales como la orina del ratón) in vivo utilizando ratones anestesiados 5-7 o animales libremente-Explorando 8. La heroica anestesiados estudios in vivo que participan (a) traqueotomía para asegurar una anestesia profunda y prevenir la aspiración del líquido estímulos 5-7, (b) la estimulación del ganglio simpático cervical 6 o canulación directa del órgano vomeronasal 5,7 introducir olores volátiles y (c) craneotomías con o sin ablaciones del lóbulo frontal para permitir el avance del electrodo en la AOB 6. Awake / comportándose estudios 8-10 implantación quirúrgica involucrados de microdrive. En suma, estos paradigmas experimentales son de gran alcance, pero extremadamente difícil y a menudo requieren anestesia.
<p class = "jove_content"> Curiosamente, varios estudios intentó mantener estructuras sensoriales y circuitos neurales descendentes vivos fuera del cuerpo (ex vivo) con cierto éxito 11-15. Debido a que las conexiones entre el OVN y AOB permanecen ipsilateral, y porque el tejido septal línea media puede estar expuesto a superperfundido oxigenada en un solo hemisferio, Hemos tratado de desarrollar un enfoque de este tipo in vivo de un solo hemisferio ex para aislar estas estructuras y manteniendo su conectividad funcional. Recientemente hemos tenido éxito en el logro de este objetivo 16. Esta preparación mantiene tanto el OVN y AOB vivo y funcionalmente conectado por lo menos 4 – 6 de HR porque tanto los axones (a lo largo de la línea media tejido septal suave) y AOB son relativamente poco profundas <600 micras características que son accesibles a superfused líquido cefalorraquídeo artificial oxigenada ( LCRa). Esta VNO-AOB ex vivo preparación permite la introducción de estímulos controlados en el VNO a través de una cánula delgada, yacceso visual directo a la pequeña AOB para la colocación de electrodos específica y / o microscopía de fluorescencia en vivo. Este método es ventajoso si se desea estudiar estos circuitos en ausencia de anestésicos. Debido a que este enfoque corta conexiones centrífugas, que no se adapta bien a las investigaciones sobre la modulación de la función centrífuga AOB. El VNO-AOB ex vivo preparación es difícil de aprender, pero una vez logrado produce una plataforma fiable sobre la que investigar la organización del circuito, procesamiento de información, y la plasticidad neural en este circuito sensorial de gran alcance.Protocol
Representative Results
Discussion
La preparación VNO-AOB ex vivo se describe en este protocolo es una alternativa útil a anestesiada in vivo 5-7 y rebanada en vivo aguda 17 experimentos de la función AOB. A diferencia de los experimentos rebanada AOB agudas, que también exponen a los elementos del circuito de registros electrofisiológicos y ópticas, esta preparación se reserva todos los aferentes sensoriales y las conexiones intra-AOB. Aunque esto también puede decirse de anestesiado en los enfoqu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) y los fondos de inicio de UT Southwestern (JPM).
Materials
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Fig. 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 0.0045" Polyimide Tubing | A-M Systems | 823400 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
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