O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.
As últimas décadas têm testemunhado a explosão do interesse científico em torno de mecanismos de controle de expressão gênica em nível de RNA. Este ramo da biologia molecular tem sido grandemente impulsionado pela descoberta de RNAs não-codificantes como principais intervenientes na regulação pós-transcricional. Tal perspectiva revolucionária tem sido acompanhado e desencadeada pelo desenvolvimento de tecnologias poderosas para criação de perfil curto expressão RNAs, tanto no nível de alto rendimento (número de identificação do genoma) ou como análise-candidato único (acúmulo de estado estacionário de espécies específicas). Embora várias estratégias estado-da-arte estão atualmente disponíveis para a dosagem ou visualizar tais moléculas que fogem, ensaio Northern Blot continua a ser a abordagem elegíveis em biologia molecular para a avaliação precisa e imediata de expressão do RNA. Ela representa um primeiro passo para a aplicação de tecnologias caras mais sofisticados e, em muitos casos, continua a ser um método preferencial para ganhar facilmente descobertasem biologia ARN. Aqui nós overview um protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs fracamente expressos (ou outras espécies de pequenos RNA reguladores) de Drosophila melanogaster embriões inteiros, dissecados manualmente tecidos / adultos ou larvas em células cultivadas in vitro. Uma quantidade muito limitada de RNA é necessária e do uso de material de fluxo de células isoladas de citometria pode ser também prevista.
RNA bioquímica tem experimentado avanços espetaculares nos últimos anos 1. A nossa compreensão de ARN potencial no controlo da expressão de genes tem sido perfurados por a identificação de poderosos noncoding ribo-reguladores 2, com a descoberta de novos mecanismos de regulação baseados no RNA 3,4 e por uma caracterização mais profunda de eventos pós-transcrição já conhecidos 5. Todos biologia RNA juntos estes estudos têm permissão para fazer drasticamente a cena, tornando-se um importante tema de pesquisa na paisagem científica atual. Em particular, nos últimos anos estamos recebendo uma noção do impacto generalizado do "mundo de RNA" em neurobiologia molecular 6, um dos campos de pesquisa mais dinâmicos da ciência da vida moderna. Na última década do século passado, o cenário científico global foi revolucionado pela descoberta da interferência de RNA 7,8 e dos pequenos RNAs regulatórios 9,10nomeadamente em matéria de microRNAs 11, endogenamente expressa pequenos RNAs não-codificantes envolvidos no controle de quase todas as funções celulares como reguladores pleiotrópicos e combinatórias de expressão gênica.
Quase 10 anos depois de miRNA descoberta inicial em Caenorhabditis elegans por Ambros e laboratórios da Ruvkun, renovada atenção voltou-se para o campo quando um elevado número de miRNAs foram identificados em Drosophila e em células humanas, bem 12-15. Desde então, graças às abordagens transgênicas versáteis, Drosophila melanogaster tem se destacado como um contexto biológico valioso para aprofundar em miRNA biossíntese e atividade. Drosophila miRNAs têm revelado funções distintas em processos de insetos específicos ou conservados evolutivamente, que vão desde o envelhecimento ao metabolismo, vias de sinalização , comportamento e, é claro, neurogenesis. Ao longo desta direção, que recentemente lançou um novo link de 16 em co intriganterrelation ocorrendo entre o gene mestre GCM / glide ea via RNA. O fator de transcrição fly Gcm / Glide 17-19 constitui um exemplo único de determinante do destino da célula, o que determina a escolha destino neuronal glial vs. em multipotentes voar precursores neurais 20. Vinte anos longa investigação sobre este tema sublinhou claramente a ocorrência de múltiplas e sobrepostas entradas de regulação da expressão gênica convergindo sobre GCM / deslizar 21-28 para estabelecer os limiares necessários para equilibrar a relação delicada entre as partes neuronais e gliais durante o desenvolvimento neural.
Descobrimos que a regulação via DMEL-miR279 segmentação representa um novo nível de controle que contribui para a pós-transcricional ajuste fino da GCM / deslizar expressão 16. Melhorias metodológicas específicas Globalmente, estas linhas de pesquisa têm exigido: ao longo dos anos, várias tecnologias originalmente desenvolvidas para analisar tradRNAs itional foram convertidos para quantificar pequenos RNAs não codificantes, como como ensaios de proteção RNase cDNA matrizes 29-31, em tempo real, métodos de PCR e sequenciamento 32-35 36,37. Por outro lado, a recalibração de abordagens técnicas promoveu avanços contínuos no campo.
Northern blot (NB, ou ensaio de mancha de gel de ARN) constitui um exemplo representativo: é largamente utilizado para o perfil de acumulação de ARN, uma vez que garante a expressão de nível de quantificação, bem como determinação do tamanho. No entanto, a fraca sensibilidade intrínseca do método é limitante quando é para ser aplicada à expressão do gene finas sintonizadores baixa abundantes, como RNAs curtos. Uma consequência prejudicial é o requisito de grandes quantidades de RNA total, o que torna difícil a sua aplicação para amostras biológicas específicas. Por tais razões, variantes NB específicos para detecção de RNAs pequenos foram desenvolvidos 38-40: aproveitamos uma melhor proc NBedure 41 (ENB, Avançado Northern Blot), enquanto elucidar a interação entre DMEL-miR279 e GCM / glide acima referido.
Este método baseia-se num passo de reticulação química com base na actividade de um derivado de carbodiimida [1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fixar o ácido nucleico em suportes sólidos. Carbodiimida é um agente de reticulação versátil conhecida para catalisar a formação de ligações amida entre os grupos carboxilo activados ou fosfato e os grupos de amina 42. Esta propriedade pode ser explorada para acoplar covalentemente pequenos RNAs através do seu grupo 5 '-hidroxilo de mono-fosforilada em grupos amino na superfície de membranas de nylon. A configuração do acessório resultante aumenta a acessibilidade do ácido nucleico imobilizado e, por sua vez, a eficiência da hibridação sonda-alvo, o que resulta em aumento notável de detecção 43.
A técnica assume particular relevance em estudos moleculares de Drosophila, pelo que a ocorrência de aulas novas e distintivas de pequenos RNAs não-codificantes está emergindo 44. Entre estes, rasiRNAs 45,46 constituem um subtipo específico de RNAs-interagindo Piwi (piRNAs 47), envolvidos no silenciamento de genes de seqüência específica. Detalhes da operação deste método estão completamente descritos e visualizadas a seguir, em relação com a análise da microRNAs DMEL-miR279 e DMEL-miR286 e, pela primeira vez, de uma rasiRNA, rasi4. Nós levado ao extremo este método, o que nos permitiu revelar alvos mal expressas de quantidades mínimas de RNA (menos de 1 mg).
Embora a nossa apreciação do sofisticado entrelaçamento por meio do qual o RNA regula a neurogênese é cada vez maior, as implicações mecanicistas de circuitos baseados no RNA que afetam a biologia neural de células-tronco, a diferenciação neuronal / integração funcional, desenvolvimento de patologias neurais e cânceres permanecem inexplorados. A manutenção dessas redes através de reinos faz com que o potencial dos sistemas genéticos como Drosophila melanogaster instrumental para desvendar camin…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, o Centre National de la Recherche Scientifique, da Université de Strasbourg, o Hôpital de Estrasburgo, a Associação pour la Recherche sur le Câncer, o Instituto Nacional do Câncer du, a Agence Nationale de la Recherche ea região da Alsácia.
Pietro Laneve tem sido apoiado pela Fondation pour la Recherche Médicale. Atualmente, ele é um receptor de um companheirismo Istituto Italiano Tecnologia (IIT). Os custos de publicação são suportados pela rede Neurex (TriNeuron – Programa Interreg IV Alto Reno)
FINAL COMPOSITION/NAME | COMPANY | CATALOGUE (Stock) | COMMENTS |
GENERAL REQUIREMENT | |||
Centrifuge, 5418 | Eppendorf | 5418 000.017 | |
Decontaminant, RNase Away | Sigma-Aldrich | 83931 | Apply on glass/plasticware, wipe and rinse |
RNase inhibitor, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | Hazardous //// 1609-47-8 |
0.1 % DEPC suspension | Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave | ||
SAMPLE PREPARATION | |||
Stereo Microscope, M60 | Leica | ||
1X PBS Buffer | |||
137 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
2.7 mM KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | 7447-40-7 |
10 mM Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | 7558-79-4 |
1.8 mM KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | 7778-77-0 |
RNA EXTRACTION/ANALYSIS | |||
UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ | Biorad | 170-8265 | |
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT | BioRad | 170-4487EDU | |
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 | Hazardous |
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | 77617 | 136112-00-0 |
Chlorophorm, 1:1 for extraction | Sigma-Aldrich | C2432 | 67-66-3 |
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing | Sigma-Aldrich | 59844 | 64-17-5 |
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0311 | |
Stop Mix | |||
300 mM NaOAc, pH 5.5 | Sigma-Aldrich | S2889 | 127-09-3 |
1x RSB Solution | |||
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 71736 | Never cool down SDS to avoid precipitation //// 151-21-3 |
2 mg/ml Proteinase K | Roche Applied Science | 0-3115828001 | EC 3.4.21.64 9 |
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB) | |||
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T5941 | 1185-53-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
30 mM MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | 7786-30-3 |
Denaturing Agarose Gel | |||
1.2% Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2 |
1x MOPS Buffer | Add when T < 60 ˚C | ||
3% formaldehayde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0 |
10X MOPS Buffer | |||
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 | Sigma-Aldrich | M9381 | Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7 |
Agarose Loading Dye | |||
1x MOPS Buffer | |||
3% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Hazardous //// 50-00-0 |
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
SMALL RNA FRACTIONATION | |||
Flat gel loading tips | Life Technologies | LC1002 | |
Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | DNA120 | |
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell | Biorad | 165-8000 | |
Denaturing Acrilamide Gel | |||
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) | Sigma-Aldrich | A3449 | Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use |
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer) | |||
7 M urea | Sigma-Aldrich | U6504 | 57-13-6 |
0.1% ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 215589 | 7727-54-0 |
0.1% TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | 110-18-9 |
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) | Thermo Scientific | SM1211 | Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction |
Acrylamide Blue Dye | |||
50% formamide | Sigma-Aldrich | 47670 | Hazardous //// 75-12-7 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 115-39-9 |
Running Buffer (RB) | |||
1x MOPS Buffer | |||
Alternative RB: 1x TBE Buffer | |||
1x TBE Buffer | |||
5X TBE | |||
445 mM Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
445 mM boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | 10043-35-3 |
20 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Gel Staining Solution | |||
Ethidium bromide 0.5 μg/ml | Sigma-Aldrich | E1510 | Hazardous //// 1239-45-8 |
1x RB | Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr | ||
BLOTTING | |||
3MM Whatman paper | Sigma-Aldrich | Z270849 | |
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX | GE Healthcare Life Science | RPN203T | Photosensitive |
CROSSLINKING | |||
Crosslinking Solution (XLS) | |||
1% 1-methylimidazole (v/v) | Sigma-Aldrich | 336092 | Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7 |
12.5 mM HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | Hazardous //// 7647-01-0 |
3.1% EDC (w/v) | Sigma-Aldrich | 3450 | 25952-53-8 |
(PRE)-HYBRIDIZATION | |||
Liquid Scintillation Counter | Beckmann | LS 6500 | |
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml | Life Technologies | AM9680 | |
rasi4 antisense probe | 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3' | ||
5s-rRNA antisense probe | 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3' | ||
Dmel-miR279 antisense probe | 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3' | ||
Dmel-miR286 antisense probe | 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3' | ||
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns | GE Healthcare Life Science | 27-5325-01 | |
(Pre)-Hybridization Solution (HS) | |||
6x SSPE | Pre-warm HS at 37 ˚C before use | ||
0.5% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | 151-21-3 |
5x Denhardt's Solution | |||
20X SSPE | |||
3.6 M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
0.2 M sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | 7601-54-9 |
20 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
50x Denhardt's Solution | |||
1% Ficoll 400 (w/v) | Sigma-Aldrich | F2637 | 26873-85-8 |
1% Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | 9003-39-8 |
1% BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | 9048-46-8 |
1X TEN Buffer | |||
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
100 mM NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 7647-14-5 |
1 mM EDTA (pH 8.0) | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
Probe Labelling | |||
0.4 μM oligonucleotide | |||
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG002A | Hazardous //// 51963-61-2 |
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer | Biolabs | B0201 | |
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl | Biolabs | M0201 | EC 2.7.1.78 |
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA | |||
WASHING | |||
Geiger Mueller Detectors | Canberra Industries | MCB2/CPS – EM77021 | |
Washing Buffer (WB), 2x SSPE | |||
Stringent Washing Buffers | |||
0.2x SSPE | |||
2x SSPE, 0.5% SDS | |||
0.2x SSPE, 0.5% SDS | |||
SIGNAL DETECTION | |||
PharosFX Plus System | Biorad | 170-9460 | |
Image J | Freely available | ||
Quantity One | Biorad | ||
X-ray films , BioMax XAR | Sigma-Aldrich | F5888 | Photosensitive |
Developer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7042 | |
Fixer for X-ray films | Sigma-Aldrich | P7167 | |
STRIPPING | |||
Stripping Solution | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.8 | Sigma-Aldrich | T1503 | 77-86-1 |
5 mM EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 60-00-4 |
0.1% SDS | Sigma-Aldrich | 71736 | Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3 |