Analyse af Tubular Membrane Networks i hjertemyocytter fra Atria og hjertekamre

Summary

I hjertemyocytter, rørformede membran strukturer danner intracellulære netværk. Vi beskriver optimerede protokoller for i) isolering af myocytter fra mus hjerte, herunder kvalitetskontrol, ii) levende celler farvning for state-of-the-art fluorescens mikroskopi, og iii) direkte billede analyse til beregning af komplekse komponenter og plasticitet intracellulær membran netværk.

Abstract

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca²⁺ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

Introduction

Hos raske tværstribede muskelceller, rørformede membran strukturer med "tværgående" orienteringer (T-tubuli) vinkelret på de vigtigste celle-aksen er rigelige. Derfor har T-tubuli blevet karakteriseret som løbende udvidelser af muskelcellen vigtigste "lateral" overflade membran (sarcolemma), der dybt trænge ind i cytosolen mod midten af ​​cellen. Den fysiologiske rolle af T-tubuli kontinuerlige med den ydre overflade membran er den hurtige elektriske kobling af fjerntliggende intracellulære rum dannet ved SER organel kontakt domæner i hele den relativt store hjertemuskel cellevolumen af nanometriske nærhed kobling af spænding-aktiverede L type Ca2 ⁺ kanaler (Cav1.2) indad (I _Ca) aktivering tilstødende ryanodine receptor (RyR2) SER Ca ^{2 +} udgivelser. I ventrikelmyocytter (FOS), de ikke-løbende kontakter membran ("kryds") mellem forbindelsesepitop SER domæner og T-tubules menes at kontrollere tusinder af individuelle intracellulære Ca2 ⁺ release nanodomains i hver celle ^1.

For en given kontakt domæne, de sammenstillede membran portioner af hver af T-tubulus og perifere (forbindelsesepitop) SER er cirka 15 nm tæt på hinanden, og derfor defineret som nanodomain. Derved er meget små individuelle cytoplasmatiske underrum adskilt som muligt kvasi celle-autonome rum adfærd. Når et indgående handling potentiale aktiverer Cav1.2 kanaler i t-tubuli VM'er, en relativt lille Ca ^{2 +} indad strøm vil stige hurtigt underrummet Ca ^{2 +} koncentration [Ca ^{2 +]} _S i attoliter størrelse nanodomain ^1. Dernæst [Ca ^{2 +]} _S stigning aktiverer Ca2 ⁺ -gated ryanodine receptorer (RyR2) inden nanometer nærhed i sidestillede SER membranen vejkryds, og denne kobling proces sker gennem hele elektrisk pard myocyt nanodomains. RyR2s forekommer som tætte multi-kanal klynger med en anslået støkiometri af 1 Cav1.2 kanal for 5-10 RyR2 kanaler ^2. Da SER-til-cytosolen [Ca2 ^+] gradient er meget stejle (forholdet 10 ^4: 1) og RyR2s fungere som high-konduktans Ca2 ⁺ release kanaler i funktionelt koblede klynger RyR2 aktivering resulterer i en kvantitativt stor Ca2 ⁺ frigive strøm fra T-tubulus koblede forbindelsemotiver SER domæner stigende lokal underrum [Ca2 ^+] _S til 100 um eller højere inden for 1-2 msek ^3,4. Denne cardiac signalforstaerkning opførsel er også kaldet Ca ^{2 +} induceret Ca2 ⁺ frigivelse (CICR). Tilsammen T-tubuli er væsentlige membranstrukturer der hurtigt aktiverer Ca2 ⁺ release signaler gennem forbindelsemotiver nanodomain SER kontakter og celle-dækkende CICR ​​under excitation-kontraktion (EF) kobling.

Ud over T-tubuli, aksial tubuluss (A-tubuli) med en markant anderledes retning parallelt med de vigtigste (langsgående) celle akse er blevet dokumenteret ved elektronmikroskopi (EM), konfokal og 2-foton mikroskopi studier. For eksempel blev en celle-dækkende kontinuerlig gitter af A-tubuli mellem myofibriller sammenkoblet med T-tubuli nær sarkomeret Z-linier vist med ekstracellulære sporstoffer og EM billeddannelse af fast marsvin VM'er ^5. Brug af ekstracellulær dextran-bundet fluorescein farvning og leve 2-foton billeddannelse af rotte VM'er blev en kompleks retikulær 3D tubulus netværk visualiseret bestående af ~ 60% T-tubuli og ~ 40% A-tubuli ^6. Denne undersøgelse ikke kun ført til 3D-visualisering af rigelige A-tubuli, men også til den erkendelse, at sektionering EM-visualisering er ifølge sagens natur begrænset til analyse af komplekse og dynamiske membran netværk som den tværgående-aksial tubulus systemet (TATS). Følgelig konfokal levende celler billeddannelse af tats membraner direkte farvet med di-8-ANNEPS blev udviklet. Hvis levende celleTats netværk analyseres ved Fourier transformation, er regelmæssig udseende T-tubulus komponenter i rummet nær sarkomeret Z-linjer afspejles af ensemblet magt spektret fra en region i tværstribede signaler ^7. Denne indirekte analyse strategi har været anvendt til at detektere celle-dækkende regionale ændringer i TATS komponent regelmæssighed i sygdomsmodeller ^7. For eksempel shRNA medieret junctophilin-2 knock-down forårsagede hjertesvigt og isoformspecifik proteinmangel resulterede i T-tubuli reorganisering med nanodomain Ca ^{2 +} frigivelse dysfunktion ^8. Vi har for nylig udvidet analyse af tats membran netværk gennem direkte kvantitative metoder og yderligere ved levende celle superresolution mikroskopi af individuelle tats komponenter i mus VMs ved hjælp af stimuleret emission depletion (STED) Nanoscopy ^9. Nanometrisk billedopløsning tilladt for direkte analyse af mindre individuel tats komponenter, som tilnærme en 50:50 fordeling af tværgåendeversus aksiale tubulære orienteringer kvantitativt bekræfter to rigelige endnu differentielt orienterede individuelle tats komponenter i raske mus hjerter ^9. Disse strategier vil blive yderligere beskrevet i protokol nedenfor.

Mens den fysiologiske rolle af de rigelige A-tubulære komponenter i den voksne hjerte er forblevet gådefuld, har EM-undersøgelser dokumenteret membranstrukturer SER forbundet med A-tubuli tyder endogene Ca2 ⁺ release nanodomains i marsvin og rotter VMs ^5,10. Konfokal analyse af Cav1.2 og RyR2 fandt en høj grad af co-lokalisering på A-tubulære kryds ^10. Da ~ 20% af spontane Ca ^{2 +} gnister i rotte VM'er opstod relativt langt væk fra Z-line riller, hvor T-tubuli typisk forekommer, har ét argument været, at faktisk kan eksistere og funktion A-tubulus associerede nanodomains som Ca ^{2 +} frigivelse sites ^11,12. Interessant T-tubulusdannelse og modning ockøtere kun efter fødslen og paralleller væksten af hjerteceller, fx gennem spiring af forstadie sarcolemmal invaginationer på P5 og umodne forgrenede TATS netværk forsamlinger på P10 i mus ^13. Det fremgår, at Junctophilin-2 er særligt vigtigt for postnatal TATS netværk modning siden shRNA knock-down forhindrede forankring af T-tubulære membraner til SER vejkryds fører til forsinket Ca2 ⁺ frigivelse og patologisk TATS organisation i overensstemmelse med umodne A-tubulus domineret arkitekturer i VMs ^13. Disse observationer kan i sidste ende føre til proof-of-concept, som T-tubuli dannes gennem membranen indkrængning processer, mens A-tubuli kan morph gennem yderligere eller endda alternative intracellulære mekanismer ^14.

Karakterisering af naturlige levesteder membran ændringer i hjertesygdom er blevet et vigtigt forskningsområde for patofysiologiske spørgsmål. De første rapporter i en hund model af pacing-induceret hjerte failure viste et underskud på T-tubuli og Cav1.2 strøm (I _Ca) ^15. En gris model af iskæmisk kardiomyopati viste nedsat T-tubulus tætheder og et reduceret synkroni af intracellulært Ca2 ⁺ frigive ^16. Ved hjælp af en spontant hypertensiv rotte (SHR) model for hjertesvigt, blev et tab på T-tubuli forbundet med reduceret nanodomain kobling af Cav1.2 og RyR2 af den foreslåede mekanisme "RyR2 forældreløst" ^7. Et tab af T-tubuli er også blevet vist i human VM'er fra iskæmiske, udvidede og hypertrofisk kardiomyopati prøver ^17. Desuden blev en stigning i A-tubuli rapporteret i vævssnit af human dilateret kardiomyopati ^18. Efter myokardieinfarkt viste vi en differentieret mekanisme TATS reorganisering i mus VM'er med betydelige fald i T-tubuli i modsætning til stigninger på A-tubulære komponenter ^9. Vigtigere, forbedret lokal membran kontrast opnås gennem levende celle superreløsning STED mikroskopi aktiveret detaljeret kvantitativ komponent analyse gennem direkte målinger, som viste betydelig spredning af A-tubuli med generelle stigninger i længde TATS nettet og forgrener kompleksitet ^9. Desuden blev det vist, at træningen kan omvendt T-tubulus remodeling hos rotter efter myokardieinfarkt ¹⁹ og at kardiel resynkroniseringsterapi kan føre til at vende ombygning af T-tubuli hunde med atrial tachypacing induceret hjertesvigt ^20. Tilsammen vil undersøgelser både i syge mennesker og dyr VM'er samt potentielle terapeutiske interventioner velsagtens gavn af høj kvalitet celleisolering procedurer og detaljerede strategier kvantitativ analyse som beskrevet i protokollen og resultater afsnittene nedenfor.

Som demonstreret for nylig af laterale overflade versus TATS membran handel med KATP kanal isoformer ^21, er det vigtigt at overveje atrial myocytes (AMS) som biologisk distinkt samt sammenlignende kardiel celle model versus FOS. T-tubuli blev for nylig dokumenteret i får og menneskelig AMS ^22. Aktuelt tyder på, at få T-tubuli findes i AM-celler og typisk i større pattedyr som får og mennesker, men ikke i små gnavere ^23. I modsætning til VM'er i AMS intracellulær Ca2 ⁺ frigivelse synes at forekomme fra celleoverfladen udbreder ved diffusion i retning af midten af cellen, hvilket resulterer i markant rumlige og tidslige ^Ca2 gradienter ^23. Inden for denne ramme forekommer vigtigt at belyse mekanismerne i intracellulær Ca2 ⁺ signalering ustabilitet for almindelig sygdom former, såsom atrieflimren ^24. Sammenfattende er både AM og VM celleisolering og hver for sunde og syge hjerter almindeligt anvendte protokoller. Kun hvis celleisolering er gjort ordentligt som bedømt ved mikroskopisk dokumentation af tilstrækkelig cellernes kvalitet, bør AM og VM prøver være carried fremad for kvantitativ TATS analyse. Følgelig Følgende protokol afsnit er kritisk afhængige af høj kvalitet celle isolater fra mus eller andre arter, efterfulgt af levende celler mikroskopi til at analysere intakte tats membraner. Som påpeget tidligere, karakterisering af tats membraner er en udfordrende forskningsområde med en tilbøjelighed til fiksering og præparationsfejl ^6, ændringer membran følge osmotiske forandringer og begrænsninger af konventionel lysmikroskopi ⁹ opløsning. Vi bemærker, at de seneste state-of-the-art-protokoller til isolering af humane AMS for Ca ^{2 +} billedbehandling og patch-clamp og rotte VMs til celledyrkning er tidligere blevet offentliggjort i dette tidsskrift ^25,26.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for University Medical Center Göttingen i overensstemmelse med human pasning og anvendelse af forsøgsdyr. 1. Isolering af Atrielle og ventrikelmyocytter fra Mouse Hjerte Håndtag dyr så skånsomt som muligt og i henhold til godkendte protokoller for at minimere stress i almindelighed og specifikt at undgå potentielle kraftige utilsigtede effekter fra neurohormonale udskejelser på isolerede hjerteceller. Derudover injiceres hver mus med heparin (500 IE / kg legemsvægt sc) mindst 20 minutter før hjertet ekstraktion til forebyggelse af blodpropper og mikro emboli, som væsentligt kan forringe udbyttet og integriteten af ​​hjerteceller under isolering. Bedøver mus på 12 uger eller ældre, ved isofluran inhalation bekræfte fravær af tilbagetrækning smerte reflekser, og aflive dyrene ved cervikal dislokation. Uddrag hjertet hurtigt efter tidligere fastsatte ekspert protokoller (se fx Kaestner et al. 26 og Louch m.fl.. 27). Undgå enhver utilsigtet skade på forkamre af unødvendige klemme eller strække. Bevare forsigtigt vævet af den proksimale aorta ascendens hjælp af et par stump pincet og lige saks til at etablere en kontinuerlig tværgående forkant gennem aorta karvæggen, hvilket er vigtigt for en vellykket kanylering og perfusion af hjertet. Overfør det udskårne hjerte straks i iskoldt nominelt Ca 2 + gratis perfusionsbuffer (til løsninger se tabel 1). Hold de store fartøjer fastspændt under overførsel gennem luft ind i buffer for at undgå utilsigtet luftembolisme indtil hjertet er fuldt neddykket. Brug BDM i bufferen og isafkølet løsninger til at hæmme kardiel sammentrækning. Brug en kikkert zoom mikroskop med tilstrækkelig 3D Illumgennemgang. Kanyle aorta under panoramiske stereovision af hjertet med en glat overflade poleret 21 G kanyle (ydre diameter 0,81 mm for normal mus hjerte vægt), som skal være helt fyldt med puffer. Sørg for, at der ikke er nogen luftbobler i kanylen ved at tilslutte en proksimal løsning reservoir (fx en sprøjte) gennem en 2-vejs Luer ventil giver mulighed for hurtig løsning flow kontrol. Bekræft under kikkert forstørrelse at kanylen er korrekt placeret i aorta, som er ca 1 mm over aorta ventiler og koronar filialer. Absolut undgå passage gennem eller utilsigtet perforering af aorta ventiler med kanylen (dette vil permanent skade aortaklaplukken og dermed forstyrre kardiel perfusion). Bind aorta forsigtigt specialfremstillede periferisk orienteret skridsikre riller nær ende af kanylen ved hjælp af to silkesuturer. Må ikke skylles koronar arteries kraftigt på ethvert punkt. Tilslut løsning fyldt kanyle bundet til aorta og hjertet til en tætsluttende udstrømning stikket på en tilpasset og præ-kalibreret perfusionssystem, alias den modificerede Langendorff opsætningen (enten ved hjælp af konstant tryk eller konstant flow, se også diskussionen nedenfor). Perfundere hjertet så hurtigt som muligt i 4 minutter ved hjælp af oxygeneret perfusionspuffer ved 37 ° C (mål perfusionshastigheden: 4 ml / min). Start fordøjelse ved at skifte perfusionen til collagenase indeholdende fordøjelse buffer (600 U / ml collagenase type II) i 8-10 min ved 37 ° C. Overvåge fremskridtene i vævsfordøjelse ved at bekræfte lignende ændringer væv bl.a. øget uigennemsigtighed, blødhed, og slap tilstand i hele den synlige hjerte overflade. Dissekere hjertekamrene efter behov følgende fordøjelse. Placer kanyle hjertet under et binokulært mikroskop og visualisere den bageste hjerte væg. Skær resterende, ikke-hjertevæv fx lunge ennd dele fartøj for at undgå forurening celle i fordøjelsen buffer hjælp af mikro saks (f.eks forår saks med 8 mm lige klinger), som vist i figur 1. Følg en tjekliste, som bestemte kamre, regioner og / eller celler i collagenasen fordøjet hjerte skal høstes (figur 1): venstre og / eller højre atrium, fri til venstre og / eller højre ventrikel væg og / eller den ventrikulære septum. Ved dissektion af specifikke hjertevæv, bruger en relativt bred og flad dissektion bad belagt med et flere mm tykt lag af silikone elastomer. Fastgør spidsen af ​​hjertet med en fin insekt stålstift til bunden elastomerlag. Afbøje højre atriale vedhæng og dissekere højre atrium lige over atrieventrikelklapperne. Fortsæt dissektion med venstre atrium. Skær og fibrøse ventilapparat kasseres. Endelig dissekere den venstre og højre gratis ventrikulære vægge og skillevæggen og / eller småare vævsdele efter behov. Bemærk kun for praktikanter: at få praksis, starte med ikke-fordøjede mus hjerter. For at lette anatomisk orientering, praksis vævet håndtering, herunder alle fortløbende dissektion skridt i henhold binokulære syn, som vist i figur 1. Når 3D anatomi, manuel håndtering under binokulære syn, og dissektion trin er tilstrækkeligt bekendt, fortsætte med collagenase fordøjet mus hjerter som skitseret ovenfor. Til ventrikulære myocytter (VM) celleisolering: overføre ventrikulære væv i 2,5 ml frisk spaltningsbuffer. Hvis samtidige celle isolationer fra flere organsystemer dele, fx atrier og ventrikler forsøges, kan en anden person, der overtager det ene ben af celledissociering procedure, både for at minimere og optimere brugen af mus gennem en koordineret håndtering af flere hjertevæv. Fortsæt med trin 1.9.1-1.9.4, derefter 1.10. Dissekere enten hele ventrikulære væveller specifikke dele heraf (fx, LV, RV, frie vægge og / eller skillevæg) i ca 1 mm 3 stykker i 2,5 ml fordøjelse buffer ved hjælp af en skarp saks (f.eks forår saks med 8 mm lige klinger) i en 60 mm petriskål . Forsigtigt adskille VM'er i celle suspension ved langsom findeling af væv stykker med en overførsel pipette. Undgå enhver luftgennembobling i celle suspension. Tilføj 8 ml stopbuffer til VM cellesuspensionen og overføre cellesuspensionen i et 15 ml konisk rør. Lad de resterende væv stykker til at afvikle på bunden i ca 15 sek, men kort nok til isolerede celler til at forblive i suspension. Dernæst høste VM suspensionen via overførsel af supernatanten volumen til et nyt 15 ml rør. Hvis store vævsstykker er til stede, alternativt bruge et minimalt 200 um afstand nylonnet at adskille vævsstykker fra cellesuspensionen. Lad VM cellesuspensionen sedimentere til bunden af ​​et 15 ml conisk rør ved hjælp af tyngdekraften i 8 min. Vask trin: fjern supernatanten og forsigtigt resuspender resterende VM pellet i 10 ml perfusionsbuffer. Gentag vask trin 1.9.5 (ekstraudstyr: tilføje ekstra vask skridt til gradvist at øge Ca 2 + koncentration som nødvendigt). Resuspender afvikles VM pellet i 10 ml perfusionsbuffer og fordele de resterende cellesuspension volumen i 1,5 ml mikrocentrifugerør (ca. 50.000 VM celler pr rør). Til atrial myocyt (AM) celleisolering: overføre fordøjet / dissekeret atrievævet i 1 ml frisk spaltningsbuffer. Skær delvist fordøjet atrievævet i ca 1 mm 3 stykker i 1 ml fordøjelse buffer hjælp af mikro saks i en lille petriskål (fx diameter 60 mm). Forsigtigt adskille AM-celler ud af de fordøjede vævsstykkerne i celle suspension ved hjælp af triturering med en 1 ml plastpipette med et snit spids for at undgå skadelige fluidumstrålerne. Underfindeling strengt undgå enhver luftgennembobling i celle suspension. Efter mekanisk omrøring, tilsættes 4 ml stopbuffer (50 uM CaCl2, 10% BCS) til at anholde en resterende collagenaseaktivitet i celle suspension. Overfør AM cellesuspension i en 15 ml konisk rør. Lad de resterende væv stykker til at afvikle på bunden i ca 15 sek, men kort nok til de isolerede celler til at forblive i suspension. Høst supernatanten volumen indeholdende de frie AM-celler via opløsning overføres til en ny 15 ml rør. Centrifugeres AM cellesuspensionen, fx 2 minutter ved 20 xg ved stuetemperatur eller – at foretrække til undersøgelser membran – lad cellerne slå sig ned langsomt ved hjælp af tyngdekraften i 20 min i en 15 ml konisk rør. Vask trin: kassere supernatanten og forsigtigt resuspender AM pellet i 5 ml perfusionsbuffer. Gentag 1.10.4. Resuspender AM celler forsigtigt i 5 ml perfusionsbuffer. Fordel cellesuspensionen volumen i 1,5 ml mikrocentrifuge badekares (ca. 1.000 AM celler pr rør). Analysere og dokumentere den isolerede kvalitet cellepopulationen for hvert hjerte, herunder celleudbytte hjælp trypanblå farvning. Til dette, fortyndes 500 pi af cellesuspensionen som 1: 1 vol / vol med trypanblåt-opløsning (slutkoncentration 0,02%) under anvendelse af 1 ml skåret pipettespidser. Bland cellerne og trypanblåt forsigtigt ved meget langsomt op / ned pipettering. Umiddelbart anvende trypanblåt indeholdende cellesuspension til et Neubauer-typen forbedret cytometeret og tælle de intakte myocytter anvendelse af et omvendt mikroskop. Udelukke eventuelle celler med synlige skader, bleb'er, sprængte riller, kontrakturer og celler ophobes intracellulært trypanblå (figur 2). Også udelukke spontant kontraherende celler, som er modtagelige for efterfølgende celledød. For at vurdere tælling af intakte celler i suspension, kun bruge hjertemyocytter med regelmæssige riller, som udelukker trypanblå helevolumen celle. Døm integriteten af ​​individuelle atrielle og ventrikelmyocytter ved gennemlysning lysmikroskopi. Gem den lyse felt image som en TIF-fil til dokumentation og yderligere analyse. Brug følgende kriterier for analyse af kardiel celleintegritet: bekræfte tilstedeværelsen af ​​regelmæssige riller i hele cellevolumen synlig; bekræfte den kontinuerlige integritet cylinderflade membran på begge cellesider parallelt med myofilaments; visualisere skarpe savtakker ved de indskudte skiver på begge cellesiderne som afspejler integriteten af ​​specifikke overflade membran strukturer; og visualisere de fluorescerende signaler af tats membraner (eller immunolabeled caveolin-3-protein eller andre membran markører), som beskrevet i afsnit 3 for lokalisering korrelation siden den underliggende celle-specifikke lyse felt billede morfologi (fx kombinere begge billeder med ImageJ som overlay sammensatte image). Bestem sarkomeret længde fra de lyse felt billeder. For gennemsnitlig sarkomer længde, måle afstanden fra sekventielt justeret sarkomeret riller, og dividere afstanden med antallet af sarkomerer. Måle mindst to steder per celle. Udfør analysen med kommerciel software eller offline med ImageJ. BEMÆRK: Hvis behandling med afkoblingsmidler, intakt afslappet VM'er fra mus hjerte viser en gennemsnitsværdi sarkomer længde på ~ 1,9 um 28. Kvantificer morfologien og dimensionerne for de enkelte atrielle og ventrikulære myocytter fra transmitteret lysmikroskopi billede. Overvej, at AM og VM-celler afviger betydeligt i størrelse. Mål celle længde, bredde og areal, og beregne længden: bredde-forhold. Analyser 2D celledimensioner fra transmitteret lys billedet i ImageJ med kommandoerne polygon markeringsværktøjet og tilføje til ROI manager, analog til figur 3. Hvis morfologiske CNDRINGER forventes inden for bestemte forsøg sammenhænge yderligere dokument til alle celler den specifikke mus stamme, alder, køn, hjerte størrelse og eventuelle tiltag for efterfølgende data klassifikation. 2. Farvning af tats membraner i Living Atriel og ventrikelmyocytter Indlæse imaging kammer (f.eks POC-R2) med en 42 mm dækglas. Til stabil myocyt tilknytning til dækglasset, forberede 20 ul laminin opløsning ved 1:10 fortynding af laminin lager i fysiologisk perfusionsbuffer (slutkoncentration 0,2 mg / ml). Spred 20 ul laminin løsning jævnt på dækglas. Forbered 800 pi af en 50 pM di-8-ANEPPS opløsning i perfusionsbuffer. Til dette, fortyndes 20 pi 2 mM di-8-ANEPPS stamopløsning i 780 pi fysiologisk buffer. At bejdse VM'er, lad cellerne afregne ved tyngdekraft i 8 min i en 1,5 ml reagensglas. At bejdse AMS enten bruge tyngdekraften sedimentering eller spi cellesuspensionen i 2 min (se 1.10.3). For både AMs og VM'er, forsigtigt fjerne supernatanten og samtidig undgå unødvendig uro i cellepelletten og forsigtigt resuspender cellepelleten i 800 pi di-8-ANEPPS opløsning (50 uM). Umiddelbart overføre di-8-ANEPPS / myocyt suspensionen på laminin-overtrukne dækglas i billedbehandling kammer. Farv VM suspensionen i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Langsomt fjerne overskydende volumen via opadgående fluid menisken ved siderne af den billeddannende kammer med en manuel pipette. Bekræft, at størstedelen af ​​di-8-ANEPPS farvede myocytter forbliver solidt fastgjort til laminin-overtrukne dækglas og ikke bliver udsat for luft. Dernæst vaskes vedlagte myocyt suspension en gang ved langsomt at tilsætte 1 ml perfusionsbuffer efterfulgt ved at fjerne eventuel overskydende væske, herunder ikke-klæbende celler. Overlay forsigtigt de farvede og overflade knyttet myocytter med 1 ml perfusionsbuffer langsomt fra siden af ​​than imaging kammer. Placer imaging kammer på mikroskopbordet. 3. Scanning af TATS membranstrukturer i Living Atrielle og ventrikelmyocytter I almindelighed, omhyggeligt vælge den bedst mulige fluorescerende mikroskop option (r) til rådighed for TATS membran billeddannelse. Til konfokal billedbehandling, overveje nyere generation, moderne fluorescens mikroskoper med optimerede PMT array-detektorer og foton genbrug veje, der maksimerer fluorescerende signal intensitet. Til konfokal billeddannelse af mindre detaljer TATS membranstrukturer bruge en 63X 1,4 NA olie objektiv eller – afhængig af tilgængelighed – brug en STED superresolution mikroskop for mindste tats detaljer, som revideret til myocyt-specifikke ansøgninger fra Kohl m.fl. 34 for generelle principper for høj. opløsning fluorescensmikroskopi, se diskussionen sektion. Indstil de billeddannende parametre til at registrere de fleste, ideelt al di-8-ANEPPS farves intracellulær membraner inde i en given myocyt afbildningsplanet. Brug følgende parametre som udgangspunkt for konfokal laserscanning mikroskopi: excitation 458 nm fx ved 3% af den maksimale laser magt; detektere den udsendte signal mellem 550 nm og 740 nm; detektor gevinst (fx mester kommando 800); og pinhole 1 AU for en optisk skive tykkelse på 900 nm. Juster disse parametre for at optimere signal-støj. Brug lyse felt til at vælge det intakt AM eller VM celle som passende (figur 4A og 4B). Der henvises til punkt 1.12 til relevante kriterier Hvordan til at bedømme celleintegritet at vælge celler som opsummeret: celle-dækkende regelmæssige riller og lige sarkomeret afstand, skarpe overflade kanter og takkerne på alle fire cellesider, løbende integritet laterale overflade membran og fravær af eventuelle bleb'er. Tag en prøve billede af en central intracellulær myocyt sektion. For at justere ROI bruge "crop" funktionen →, Justere afgrøde vinduet → den endelige pixelstørrelse måler 100 nm x 100 nm. Juster x-aksen af ​​afgrøden vinduet til at korrespondere med de store (aksial / langsgående) akse myocyt. Vælg den endelige afbildningsplanet. Brug enkelt billedrammer at vælge den rigtige afbildningsplanet i z-retningen manuelt. Bekræft at de tats membraner, herunder T-tubulus og A-tubulus komponenter er umiddelbart synlige i brændplanet. Bemærk, at en typisk intracellulær billedplanet kan omfatte en kerne som intracellulær referencepunkt. Der henvises til eksemplerne i figur 4A og 4B. BEMÆRK: I almindelighed holde celle udsættelse for laserlys så kort som muligt. Hvis det er muligt, skal du bruge en enkelt billedrammer at bestemme den optimale fokalplan i hjertemyocytter. Juster pixel opholdstid til cirka 0,5 usek. Vælg 16x udjævning og optage billedet som snapshot. Gentag billede snapshot skridt at fastsætte den passende afbildningsplanet ens skitseret for membranstrukturer Tats i 3,5 efter behov. Gem det endelige billede, og bekræfter, at filen blev gemt i mappen sit mål. Generelt gemme alle billedfiler i samme format (f.eks LSM) for ensartet anvendelse af analyse software. Forud for enhver billedanalyse, endnu engang bekræfte tilstrækkelig celleintegritet off-line (overveje kriterier i trin 1.12.1), og udelukke eventuelle beskadigede celler fra analysen. Der henvises til eksemplerne i figur 4C og 4D. 4. Analyse af TATS Membrane Netværk og dets komponenter Følgende billede bearbejdningstrin til direkte analyse af tats membran komponenterne er sammenfattet som top-down arbejdsgang diagrammet i figur 5A og 5B. Åbn billedfil af en di-8-ANEPPS farvede myocyt i Fiji (http://fiji.sc/), en frit tilgængelig variant af ImageJ som indeholder analyse plugins er essentielle forbilledbehandling. For yderligere information henvises til Schindelin m.fl. 29. Gem billedet → Filer → Gem som → Tif. At analysere membrankomponenterne tats, vælge den relevante ROI eksklusive ydre overflade membran-signal og derefter bruge "polygon Selection" værktøj til at afgrænse ROI grænse, den ydre overflade membran (sarcolemma), herunder de intracellulære dele af naturlige levesteder membraner, som vist i Figur 5A (ROI). Tilføj det valgte ROI til "ROI Manager" ved at anvende Analyser → Værktøjer → ROI Manager. At vælge en specifik ROI for orienteringen analyse af tats komponenter, justere de vigtigste langsgående celle akse og billedet x-aksen parallelt. Hvis cellen er svagt buet, skal du vælge flere ROIs og tilpasse hver ROI individuelt. Udelukke eventuelle kerner fra analysen. Udelukke enhver overdrevent buede celler fra analysen, fordi præcis justering af ROis bliver stadig vanskeligere og øge orientering fejl under analysen. Slet uønskede signalinformation fra den ydre overflade membran: Ret → Klar Uden at generere "udvalgt ROI" (figur 5A). Sørg for, at den valgte ROI kun indeholder de intracellulære membran portioner, som svarer til de TATS netværket. Udfør følgende kæde af billedet procestrin (kommandoer) forud for den efterfølgende kvantitativ analyse som dokumenteret i figur 5A. Klik på → Proces → Fratræk Baggrund. Indstil rullende kugle radius på 5 pixels. BEMÆRK: Indstil rullende kugle radius på 5 pixels, hvis billedet skal analyseres har en pixelstørrelse på 100 nm x 100 nm. For andre pixel størrelser indstille rullende kugle radius til antallet af pixels, som omtrent svarer til en fysisk radius på 500 nm. Klik på → Proces → Forbedre Lokal kontrast (CLAHE). Indstil blokstørrelse til 49, histogrammet siloer til 256, den maksimale hældning til 3, og masken til "ingen". Klik på → Proces → glat. Klik på → Plugins → Segmentering → Statistisk Region sammenfletningen. Indstil parametrene til Q100 → klik på Vis Gennemsnit. Bekræft fuldstændig behandling af den statistiske område fusionerende angivet med automatisk præsentation af en ny billedramme, og bekræft, at etiketten "SRM Q = 100" vises. Fortsætte de følgende trin med denne billedfil. Klik på → Billede → Type → 8-bit. Klik på → Billede → Juster → Threshold. Vælg tærsklen tilstrækkelig lav til at registrere de fleste, ideelt alle tats strukturer, især undgå at udelukke naturlige levesteder komponenter med et lavt signal intensitet (brug en tærskel på 40 som udgangspunkt). Se afsnittet om "Repræsentative resultater" for detaljerede data, output og eksemplerne i figur 6(Øvre grænse på 255). Dokumentere det endelige valg af tærskelværdier parametre. Bemærk, at det rigtige valg af tærskel skal producere kun bestemte TATS membranstrukturer men ikke falske positive signaler på grund af baggrundsstøj. Bekræft korrekt sammenlægning af tats billeddetaljer versus udtrukne skelet-data, især for mellemliggende og høj fluorescens signal niveauer, der skal matche (displayet) kontinuitet i skelet struktur. Når en passende tærskel er blevet identificeret, anvende denne samme tærskel for alle billeder under analyse og gentag overlay sammenligning af det oprindelige signal versus skelet data til konsekvent at minimere denne potentielle kilde til bias. Klik på → Apply: billeddata bliver binær som vist i figur 5 under "Threshold". Klik på → Plugins → Skeleton → Skeletonize (2D / 3D). Gem skeletonized 2D-billede (som vist i figur 5) som TIF-fil vedklikke på → Filer → Gem som → Tif. Analyser skeletonized billedfil til kvantitative data output ved at klikke på → Plugin → Analyser Skeleton (2D / 3D). Vælg Prune cyklus metode: ingen. Bekræft automatisk generering af de resulterende data tabellen. Gem den automatisk genererede data tabel som txt-fil. Vælg de relevante kvantitative parametre, f.eks, det samlede antal filialer punkter eller gennemsnittet filial længde som vist ved eksempler data i figur 7. Overveje yderligere dataanalyse med supplerende / understøttende software værktøjer som Excel og som passende. Overvej at bruge automatiserede billede håndteringsrutiner når det er muligt, herunder alle de nødvendige skridt, der er beskrevet under 4.5 at harmonisere analyse mellem de enkelte billeder og / eller billeder partier. Brug eksemplet Supplerende kodeks fil, der indeholder et billedbehandlingsprogram Makro programmeret til Fiji (justere programmeringen efter behov). Analyser ienkelte orienteringer af alle eller udvalgte TATS netværkskomponenter fra skeletonized billeddata fra Fiji plugin "Direktionalitet". Generer en retningsbestemthed histogram, hvor de respektive aksialt orienterede A-tubulus eller tværs orienterede T-tubulus komponenter er repræsenteret ved de 0 ° eller 90 ° siloer. Bemærk den korrekte henvisning billedets orientering, og at det er vigtigt for x-aksen af billedet for at svarer nøje med de vigtigste (langsgående) 0 °-aksen i VM celle som vist i figur 8 og Repræsentative resultater. Klik på → Analyser → Directionality → specificere Metode: Fourier komponenter Nbins 180, histogram starte -45 → klik på Skærm bordet. Gem den nyligt genererede og vises resultat tabellen herunder tilknyttede histogramdata som txt-fil. Overveje yderligere analyse af txt-fil data ved gratis software værktøjer som Excel og efter behov. For at generere underklasser afdata som grupperede datasæt fx til alle celler behandlet under de samme betingelser (og potentielt andre betingelser), gentages analysen trin 4,1-4,7 for alle relevante billeder som relevant. Importer skeletonized dataparametre fra alle billeder i en kombineret Excel-fil med henblik på at udlede gennemsnitlige værdier. Derudover importere alle retningsbestemthed histogramdata fra samme grupperet datasæt ind i en kombineret Excel-fil til at beregne og generere den gennemsnitlige retningsvirkning histogrammet. Overveje yderligere behandling af grupperede datasæt til at analysere yderligere TATS netværk parametre af interesse for individuelle eller mellem forskellige behandlingsgrupper efter behov.

Representative Results

Hertil kommer, at analysen af TATS membran nettet en række almindeligt anvendte cellebiologiske teknikker som intracellulær Ca2 + billedbehandling, patch-clamp elektrofysiologi, eller farmakologiske dosisresponsundersøgelser afhænger kritisk på høj kvalitet primær celle isolation fra forkamre eller ventriklerne eller vælg dele af hjerte væv for at muliggøre karakterisering af modne differentierede, strukturelt og fysiologiske intakte hjertemyocytter. Derfor isolation og kvalitetsvurdering for AM og VM-celler er beskrevet i afsnit 1, er i sidste ende nyttige for mange forskellige spørgsmål, herunder den her beskrevne TATS netværksanalyse, er kritisk afhængig af intakt membran og celle integritet. Figur 1 giver en trinvis vejledning af billeder, hvordan vi kommer videre med den hjertevæv dissektion begyndende med de atriale kamre i mus hjerte. Efterfølgende ventrikulære kamre og skillevæggen udarbejdet end dissekeret efter behov. Præcis udvælgelse og forberedelse af de korrekte vævsdele er vigtigt at fastsætte en pålidelig AM og VM isolationer med tilstrækkelig celle renhed. Efter collagenasefordøjelse det kan være relativt vanskeligt at identificere den korrekte linje dissektion mellem atriel og ventrikulær væv, men når AM og VM cellerne blandes ukontrolleret i cellesuspension, er det umuligt at vende den blandede cellepopulation. Derfor anatomiske orientering, 3D væv visualisering, tilstrækkelig erfaring med fordøjet væv håndtering, korrekt identifikation af specifikke væv dele og deres dissektion linjer vil alle bidrage til succes for cellens isolation. Figur 1.Dissection af atrievævet. (A) vender den forreste del af hjertet, to kirurgiske sutures fastsætte den proksimale aorta til stub slutningen af en 21 g stål kanyle. (B) Udsigt mod hjertet basispoint viser resterende lungevæv obstruerer atriumkammer udsigt under dissektion. LA, venstre atrium; RA, højre atrium. (C) Resterende lungtissue og store fartøjer blev fjernet for at få adgang til de atriale kamre. Fyldt sort trekant, pulmonal; tværstribede trekant, lungevener; fyldt hvid trekant, øvre hulvene; boxed trekant, lavere hulvene. (D) For det første er ret atrievæggen dissekeret mens tangen holder atrielle vedhæng. (E) Udsigt ind i højre atrium kammer. Den sorte trekant markerer intakt interatriale septum. (F) dissektion er fortsat kom ind på venstre forkammer kammer. (G) Efter fuldstændig dissektion af venstre og højre forkamre, de atrieventrikelklapperne bliver synlige. Den fibrøse ventilapparat dissekeres og kasseres til subsequently høster kun ventrikulær muskelvæv. (H) posterior baggrund af de isolerede venstre og højre forkamre. LA, venstre atrium; RA, højre atrium.Scale stænger: 700 um. For at bestemme kvaliteten af celle isolationer, Figur 2 indeholder typiske celle eksempler under vurdering af udbyttet og levedygtighed typiske stang eller mursten formede riller intakte myocytter, både AMS og VM'er. Lidt beskadiget, visuelt iøjnefaldende såvel som alvorligt beskadigede celler med unormale overdrevent buede morfologi eller unormale kugleformede celler, let kan identificeres, herunder trypanblåteksklusion som beskrevet i afsnit 1.11. Mens intakte myocytter forbliver lyst og homogent tværstribede når de udsættes for ekstracellulære trypanblåt, beskadigede celler typisk vise flere bleb'er og / eller hurtigt akkumulere trypanblåt intracellulært indikerer skader membran. Trypanblå af sig selv, kan dog skade celler gennem unnecessarily lange inkubationstid og umiddelbare vurdering cellernes kvalitet er derfor obligatorisk. Eksempler på mere åbenlyse former for celleskader ligesom myofilament kontraktur eller grov overflade skade kompromittere celleintegritet er vist i figur 4C og 4D. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. trypanblåteksklusion cellefarvning. Isoleret (A) AM og (B) VM blandes cellerne i suspension med trypanblåt og visualiseret ved en inverteret lysmikroskop vist ved 40Xmagnification. Bemærk thatabnormal sfæriske celler i (A) og (B) tager op trypanblå, der indicatesmembrane leakaGE og strukturelle skader. I modsætning hertil centralAM og VM celler med intakte membraner udelukke trypanblåt som vist. Endvidere bemærkes, at intakte AM og VM celler viser sarkomeret riller hele deres celle volumen, nomembrane blærer og skarpe kanter på begge laterale sider, og begge interkalerede diske. Skalapanelerne: 20 pm. Efter de vellykkede isolation celleudbytter af VM'er fra 5 x 10 maj-10 Juni kan forventes fra en enkelt mus hjerte fordøjelsen. Udbyttet af AMS er betydeligt lavere i størrelsesordenen 3 x 03-03 Oktober x 10 4 stavformet, trypanblåt undtagen celler. I modsætning til VM, AM isolationer lejlighedsvis mislykkes selv i erfarne hænder. Trin 1.11 opsummerer procedurer hvordan man vurdere udbyttet af isolerede raske celler i suspension. Derudover bestemme den gennemsnitlige celledimensioner gennem trin 1.13, som vist i figur 3 for individuel AM eller VM celle isolater eller at sammenligne AM versus VM cellepopulationer side-by-side (som nødvendigt). Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3.Bright felt morfometrisk analyse af hjertemyocytter. VM kontur blev opdaget af billedet analyseværktøjer beskrevet under trin 1.13. Brug polygonen markeringsværktøjet visuelt mærke og definere cellen ekstracellulære grænse defineret af den ydre overflade membran til analyse. Ad det valgte område af interesse (ROI) til ROI lederen efterfulgt af 1D afstandsmålinger. Ved sammenlignende studier af AM vs VM dimensioner, er det nyttigt at dokumentere celle længde, bredde og areal, og til at beregne længden: bredde-forhold. nt "> Til fluorescens plet tats membraner enten i AM eller VM-celler, den integrerede membran farvestof di-8-ANEPPS anvendes som beskrevet i afsnit 2, efterfulgt af konfokal mikroskopi, hvilket resulterede i de repræsentative billeder af tats netværk vist i figur 4A og 4B. Desuden 4A viser det tilsvarende transmitteret lys billede af en intakt AM side om side med det konfokale TATS billede (for billedoptagelse se afsnit 3). Som beskrevet af trin 1.12, morfologiske og overflademembranen integritet stue myocytter bedømmes gennem de transmitterede lyse billeder. Det forstørrede område af di-8-ANEPPS signalet fremhæver den underliggende morfologi TATS netværk i AMS, kendetegnet ved rigelig aksiale (langsgående) membran tubuli. I modsætning hertil TATS morfologi sund VM'er som vist i figur 4B er kendetegnet ved omtrent samme antal aksiale end tværgående komponenter. I modsætning hertil figur 4C og 4D viser eksempler på beskadigede hjertemyocytter, der skal udelukkes fra yderligere analyse. Især er AM celle i figur 4C kontraheret som det fremgår af en unormalt kort sarkomer længde på 1,2 um og en uregelmæssig, forvrænget TATS netværk henviser VM celle i figur 4D udviser flere bleb'er (nogle fremhævet af røde trekanter) med angivelse membran forstyrrelser , som kan forekomme ved den ydre overflade membran, men også på de naturlige levesteder membraner. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4.Live membranfarvning af intakt atriel og ventrikulær myocytes. svarende transmitteret lys og konfokal billeder af levende di-8-ANEPPS farvede intakt (A) AM og (B) VM-celler. I modsætning hertil er en delvist kontraheret og potentielt beskadiget AM med en sarkomer længde på 1,2 um vist i (C). Kontraherede myocytter typisk viser unormalt forkortet og forvrænget tats strukturer, derfor udelukket fra yderligere analyse. En anden vigtig indikator for cellemembran defekter er bleb'er (røde trekanter) som vist i en VM i (D). Bleb'er repræsenterer beskadigede membranstrukturer overflade og celler med blærer, bør udelukkes fra yderligere TATS analyse. Desuden VM viser brutto skade tilsyneladende mangler en hel del af sin nederste venstre del (markeret med stjerne). Sammenfattende ved at sammenligne transmitteret lys og konfokal billeder, celler morfologi og overflade intakthed er dokumenteret og kombineret med fluorescerende signal information. 'N' mærker nuclei udeladt fra analysen af ​​TATS membran pletten. Gule søjler angiver forstørret ROI'er fra samme konfokale billede præsenteret ovenfor. Skalapanelerne:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal. Konfokal billeder af tats membraner med en tilstrækkelig signal-støj-forhold som vist i figur 4A og 4B er accepteret til yderligere kvantitativ analyse. Membran analyse TATS er baseret på skeletonized data fra de fluorescerende retlinede signalkomponenter. Figur 5 viser arbejdsgangen diagram af de enkelte billede procestrin, som er beskrevet i detaljer i trin fra 4,3 til 4,5. Disse skridt producere skeletonized billeder, der repræsenterer retlinede TATS membran netværk som vist for hver isolerede VM (figur 5A) og AM-celler (Fifigur 5B). Figur 5.Workflow til skeletonization af fluorescerende tats billeder. Billede procestrin, der fører til en skeletonized billede af TATS nettet er repræsenteret ved de enkelte trin-for-trin billed eksempler både en di-8-ANEPPS farvet VM (A) og AM (B). Til individuel billedbehandling trin henvises til afsnit 4. Bemærk forskelle i skala stænger:. 20 um (A) og 10 um (B) Klik her for at se en større version af dette tal. Et kritisk trin under billedbehandling, fastsætte en passende tærskel for data binarisering som beskrevet i afsnit 4.5.6.. Det resulterende binære billede bør omfatte eneste sande membran signaler fra TATS nettet, men ikke falske strukturer afledt af fejlagtig tærskelværdiansættelse fra baggrunden signal støj. Alligevel er det vigtigt, at tærsklen er lav nok til at afsløre alle sande tats strukturer såsom at sande tats komponenter ikke fejlagtigt tabt under billedanalyse. Figur 6 illustrerer processen hvordan du vælger den tærskel under data binarisering. Mens en tærskel på 40 som vist i figur 6B og 6C forekommer hensigtsmæssigt at opdage alle sande tats strukturer individuelt, vælge en højere tærskel fx på 60, som vist i figur 6A registrerer ikke svagere aksiale membranstrukturer (ATS) som angivet med gule trekanter . I modsætning hertil, at vælge en lavere tærskel fx 20 som vist i figur 6D fører til fejlagtig detektering af baggrundsstøj falsk positive tats strukturer som indikeret vedgule trekanter. Figur 6.How at bestemme tærsklen signal under skeletonizing af tats billeddata. Eksemplerne viser tats skeletter hver genereret med forskellige tærskler under data binarisering (beskrevet i trin 4.5). Øvre billeder: Vis justeringer tærskel hjælp Fiji. Lavere billeder: overlejring af skeletonized billeder med den tilsvarende indgang fluorescensbillede og forstørrede områder som angivet. En høj tærskel fx 60 anvendes i (A) er tilsyneladende ikke hensigtsmæssigt at opdage alle sande tats strukturer som indikeret med gule trekanter i det forstørrede afsnit. En tærskel på 40 anvendes i (B) og (C) registrerer alle tats strukturer og korrekt registrerer ikke baggrundsstøj, mens en lav tærskel f.eks., 20 i (D) fejlagtigt identificerer baggrundsstøj som tats strukturer og derved skaber falsk-positive signaler for ikke-eksisterende membran strukturer. Falsk-positive signaler er angivet med gule trekanter i det forstørrede indsatte. Klik her for at se en større version af dette tal. Den "Analyze Skeleton (2D / 3D)" plugin understøtter den detaljerede analyse af skeletonized tats strukturer. Når henrettet, plugin producerer en datatabel med følgende skelet parametre: #branches, #junctions, # slutpunktsmulighederne voxel, gennemsnitlig filial længde, #triple punkter #quadruple punkter, og maksimal gren længde. For en detaljeret beskrivelse af alle mulige outputparametre påhttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton og relaterede artikler 29-31. En typisk datatabel produktion er vist i figur 7A. <pclass > Parametrene kan endvidere anvendes til at udlede den totale skelet længde pr areal eller antallet af kryds pr område. Eksemplarisk beregning af antallet af filialer multipliceret med den gennemsnitlige gren længde giver den samlede længde af den kontinuerlige skelet i 2D: Samlet skelet længde pr ROI: Σ (#branches x gennemsnitlig gren længde) = 5155 px = 515,5 um Den samlede længde af skelettet kan normaliseres til billedet området. For vist i figur 7 normaliseret skelet længden af 0.64μm eksempel / um 2 og summen af alle vejkryds er beregnet som vist nedenfor: Normaliseret skelet længde: 515,5 um / 803,6 um 2 = 0,64 um / um 2 Normaliseret antal vejkryds: 155 kryds / 803,6 um 2 </sup> = 0,19 kryds / um 2 Figur 7.Automated udlæst fra skeletonized billeder. (A) En typisk data regneark genereret af 'Analyze skelet (2D / 3D) "plugin fra skeletonized billede vist i (B). For en detaljeret beskrivelse af mulige output-parametre henvises til http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . Klik her for at se en større version af dette tal. Billedbehandling, der er beskrevet under 4.5 og illustreret i figur 5 kan automatiseres ved hjælp af en Fiji makro som supplerende kodefil </strong>. Kommandoerne definere gentagelser af billedbehandling gennem reiterative trin. Makroen kan anvendes til at fuldføre stakke af inputbilleder produceret gennem trin 4.3 og 4.4. Makroen kan være fordelagtigt for analyse af komplette datasæt grupper, for eksempel ved at udarbejde individuelle input billedstakke for hver selvstændig behandlingsgruppe til automatiseret analyse ved hjælp af makro-kommandoer. Den skitserede software strategi yderligere muliggør orientering analyse TATS netværk for alle komponenter. Til dette skal du bruge "Direktionalitet" plugin (http://fiji.sc/Directionality) 29,31 som producerer histogramdata viser orienteringen distribution af alle TATS komponent orientering. Hvis x-aksen af ​​input billedet svarer til hovedaksen af ​​et givet AM eller VM-celle, den aksiale (langsgående) tats komponenter vil være repræsenteret ved 0 ° bin, mens de tværgående komponenter vil være repræsenteret ved den 90 &# 176; bin. Figur 8 viser eksemplarisk retningsvirkning histogrammer fra skeletonized tats billeder til en VM (8A) versus en AM (8B) celle. Mens retningen histogram over en typisk VM viser en dobbelt top fordeling ved 0 ° og 90 °, AM Histogrammet viser en dominerende top ved 0 °. Disse eksempler er i overensstemmelse med tidligere observationer, at individuelle tats komponenter af VMs næsten er jævnt fordelt mellem T-tubuli og A-tubuli, mens tats komponenter i AMS kan hovedsageligt består af A-tubuli. Figur 8.Representative retningsvirkning histogram fra tats netværk af enkelte celler. Retningsknapperne histogrammer blev genereret fra skeletonized billeder af individuelle VM (A) i forhold til AM (B </strong>) tats netværk. Da x-aksen for det analyserede billede svarer til det vigtigste (langsgående) akse i myocyt som vist, er A-tubulus komponenter repræsenteret ved 0 ° bin, mens T-tubulære komponenter er repræsenteret ved 90 ° skraldespanden. Gauss passer kun til de store histogram peakasshown som baggrund graf. Klik her for at se en større version af dette tal. Perfusionsbuffer mM NaCl 120,4 KCI 14.7 KH 2 PO4 0.6 Na 2 HPO 4 0.6 MgSO4 1.2 HEPES 10 NaHCO3 4.6 Taurin 30 2,3-butandion-monoxim 10 Glukose 5.5 pH 7,4 Fordøjelse puffer mM (hvis ikke specificeret) NaCl 120,4 KCI 14.7 KH 2 PO4 0.6 Na 2 HPO 4 0.6 MgSO4 1.2 HEPES 10 NaHCO3 4.6 Taurin 30 2,3-butandion-monoxim 10 Glukose 5.5 Kollagenase type II 600 U / ml pH 7,4 Stop-buffer mM (hvis ikke specificeret) NaCl 120,4 KCI 14.7 KH 2 PO4 0.6 Na 2 HPO 4 0.6 MgSO4 1.2 HEPES 10 NaHCO3 4.6 Taurin 30 2,3-butandion-monoxim 10 Glukose 5.5 CaCl2 0,0125 bovinkalveserum 10% pH 7,4 Tabel 1.Buffer solutioner. samlet indhold af tre forskellige fysiologiske pufferopløsninger til celleisolering og billeddannelse.

Discussion

Selv hjertemyocytter er blevet isoleret og undersøgt i årtier ³² indgik en nylig gennemgang, at der konsekvent høj kvalitet myocyt celle isolationer forbliver udfordrende ^27. Dette afspejler forholdsvis komplekse protokoller for isolering af primære hjertemyocytter vis-a-vis en mangel på fælles standard fremgangsmåder, fælles metadata og gennemskuelig dokumentation cellernes kvalitet. Celleisoleringen protokoller er normalt tilpasset af enkelte grupper, give variable resultater af celle-isolater, afhænger af de konkrete model indstillinger (f.eks art, alder, sameksisterende hjertesygdomme), og er normalt korrigeret for særlige eksperimentelle betingelser. Inden for rammerne af den kvantitative TATS membran studier og protokoller, der præsenteres her, en væsentlig grad af skøn og dokumentation kvalitet vedrører konfokal eller superresolution mikroskopi af individuelle celle membranstrukturer tilbøjelige til metaboliske og isolation protokol afhængige forandringer, bådei AM eller VM. Vigtigere er det, selv om høje udbytter af celle isolater tyder sund og intakt myocytes nødt efterforskere til at dokumentere og kritisk vurdering af de enkelte celle omhyggeligt mod morfologiske kriterier overflade og TATS membran integritet versus ikke-specifik skade på grund af isolationsprocedurer versus specifikke ændringer som følge af forskellige typer af interventioner i forhold til at styre betingelser. En vigtig variabel under hjerteiskæmi celleisolering er den specifikke aktivitet af et givet kollagenase parti. Sådan vælger du et nyt lot collagenase, bør den enzymatiske aktivitet af flere kollagenase testes mod hinanden ved at vurdere hjertefunktionen myocyt udbytte og kvalitet, og i overensstemmelse med producentens anvisninger. Ideelt set et nyt lot collagenase identificeret med collagenase aktivitet svarende til de tidligere med held anvendte partier (for udvidet evaluering af mulige enzymaktiviteter se "collagenase parti markeringsværktøjet" i materialer og metoder tabel). Taken sammen, kvantitative metoder i TATS membran visualisering afhænger kritisk celleisolering kvalitet, og omvendt, hjerte celle isolationer fører til uspecifik skade membran, som dokumenteret af TATS mikroskopi bør udløse kritisk gennemgang og korrektion af isolation procedurer. Da celleisolering kvalitet og TATS membran visualisering og kvantificering er uløseligt forbundet, protokollerne omtales i denne artikel dækker alle større aspekter som en kontinuerlig strategi.

En yderligere udfordring og fælles problem af hjerte undersøgelser, celleskader og / eller celler tab opstår på grund af metabolisk kompromitterende interventioner fx, efter myokardieinfarkt ^9, men skal vurderes i forhold til potentiel utilsigtet skade fx efter ubemærket luftembolisme under celleisolering. Isolering af hjertemyocytter fra syge hjerter kan føre til yderligere, betydelige tab celle og nedsat celleudbytter. Derfor sammenlignelighedmenligning af det samlede antal af isolerede intakte celler mellem kontrol og syge hjerter kan være meningsfuld, hvis celle isolering og tælling anvendes konsekvent gennem standardiserede protokoller. Derfor er det vigtigt at bedømme celleintegritet gennem en passende kontrolgruppe, hvilket afspejler den bedst mulige myocytcellestørrelse isolation kvalitet. Vigtigere, individuel celle kvalitet og levende celler mikroskopi af sunde versus syge versus myocytter uforvarende beskadiget af isolation procedure kan influere betydeligt på analysen af ​​tats membran netværk. De protokoller, der præsenteres her derfor understrege integritet og stabilitet fysiologiske membran komponenter under celleisolering og levende celler mikroskopi af intakte membraner. Hele arbejdsgangen er udformet som en kontinuerlig strategi for at opnå og bevare intakte TATS membrankomponenter samtidig at udelukke beskadigede celler, da disse vil udstille isolation afhængige membran artefakter som sprængte membran tubuli membrane blærer og ændrede tats netværk fejlagtigt under kontrol betingelser og kompromittere yderligere kvantitativ analyse. Omvendt er de samme strategier er afgørende for interventionsstudier med potentiale til at forstyrre tats membraner, der afhænger kritisk på meningsfulde kontrol sammenligning mellem sandt sund versus ægte syge celle med tats membran ændringer.

Derudover har vi fat procedurer for at opnå den teknisk meget mere udfordrende isolering af AM-celler. Trods fremskridt og forbedrede protokoller, er det vigtigt at understrege, at det er ikke trivielt at gengive høj kvalitet celle isoleringer af VM'er og endnu mindre pålidelige for AMS. Dette skyldes, at den generelle lavere udbytte af AM-celler, hvor selv små fejl eller variationer i løbet celleisolering kan føre til at fuldføre fiasko AM celleisolering, mens en mild grad af VM celleskader kan være mindre synlige i celle suspension følge af relativt høje celle tal i forhold til AM. Da AM-celler kan blive curved efter isolering, kan analysen gennem flere ROIs være en fordel som skitseret i trin 4.3. Efter en detaljeret procedure for celleisolering trin, giver vi en protokol for direkte integreret membranfarvning og konfokal eller STED superresolution billeddannelse af tats netværk både VM'er og AMS. Disse protokoller gør det muligt både kvantitativ analyse og differentiering af udvalgte komponenter af tats membraner gennem tidligere fastsatte parametre. I forhold til VM'er, 3D-organisationen og funktionelle adfærd af den atrielle TATS netværk i AMS er i øjeblikket mindre forstået.

Procedurerne til billedet tats membraner i levende celler (trin 3.1 til 3.7) blev udviklet med kommerciel konfokal (Table of Materials / udstyr) og skræddersyede STED fluorescens mikroskoper ^9. For at optimere mikroskop indstillingerne for fluorescerende billeddannelse og kvantitativ TATS analyse, er følgende punkter af generel betydning:

• Formål </strong>
  For at løse små detaljer i naturlige levesteder membranstrukturer empirisk teste, hvilke mål giver den højeste billedkvalitet og samtidig fokusere flere mikrometer dybt i cellen. Visse konfokale mikroskoper kan klare sig bedre med vand eller glycerol målsætninger, i modsætning til 63X 1,4 NA olie målsætning her. Målsætninger med 100X forstørrelse anvendes til superresolution STED mikroskopi, handel fra en mindre synsfelt til nanometrisk beslutning ^34.
• Excitation og Gain
  De optimale indstillinger af magnetiseringseffekt og detektor gevinst afhænger af mikroskop lys sti, laserydelse, og prøve egenskaber. Ideelt set er laser magt og vinde justeret til at udnytte hele spektret af detektoren, og alligevel undgå billedet mætning. Kommercielle mikroskopi softwarepakker giver normalt opslagstabeller, der visualiserer den nedre og øvre grænse for det dynamiske område. Desuden, for at minimere farvestof blegning anvende den lavest mulige lAser magt, som stadig giver tilstrækkelige strukturelle TATS membran detaljer. Desuden bør magnetiseringseffekt være lav nok til at undgå kumulativ tilgængeligt beskadigelse fører til myocyt kontrakturer og død.
• Pixel Størrelse
  Brug en pixelstørrelse kompatibel med Nyquist sampling, omtrent halvdelen af ​​den opløsning opnås med de givne indstillinger. Til konfokal billeddannelse en pixelstørrelse på 100 nm x 100 nm er kompatible, hvilket også vil begrænse blegning. For superresolution mikroskopi betydeligt mindre pixel størrelse, benyttes fx 20 nm x 20 nm for STED mikroskopi ^9.
• DVÆLETID
  Konfokale mikroskoper giver en gennemsnitsbestemmelsesfunktion. Generelt skal du bruge den kortest mulige pixel opholdstid for at undgå blegning i kombination med signalet gennemsnitsberegning f.eks line-gennemsnit ≥ 8 for at forbedre signal-støj-forholdet.
• Dokumentere Applied Microscopy indstillinger via meta-data
  Når indstillingerne hvordanbilleddetaljer af membranstrukturer tats blev optimeret på en bestemt konfokal mikroskop, sikker og / eller dokumentere de indstillinger (protokol meta-data). Anskaf alle billeder i en (eller mellem) gruppe (r) af celler med samme formål, magnetisering magt, vinding, pixelstørrelse, pixel opholdstid, og gennemsnit funktion. Lige billeddiagnostiske betingelser muliggør direkte sammenligning og kvantificering i en (eller mellem) gruppe (r) af celler.
• For generel vejledning og yderligere oplysninger om principper og anvendelser af Konfokalmikroskopi henviser til Håndbogen of Biological konfokalmikroskopi (Pawley JB, ^3. udgave, 2006 Springer Science + Business Media, LLC).

I modsætning til de strategier direkte analyse præsenteres her, tidligere publikationer, der beskriver tats membraner og sygdomsrelaterede ændringer, har brugt regionale aggregerede udlæsninger af T-tubulus massefylde som kvantitativ strategi ^16,17 eller indirekte regionale strategier baseret på Fourier Transfsninger analyse af tværstribede membran signaler for at vurdere T-tubulus komponent regelmæssighed ^7. I modsætning hertil er de kvantitative metoder, der beskrives her direkte relateret til de enkelte tats komponenter, og giver en række yderligere parametre, herunder membran netværk egenskaber og specifikke komponenter som den procentdel af A-tubuli. Endvidere kan TATS netværk tæthed kvantificeret som den normaliserede længde af hele ekstraheret skelet pr ROI område. Antallet af tredobbelt kryds af tre enkelte, kan kontinuerligt forbundet tubulære komponenter anvendes som et mål for den forgrening kompleksitet TATS membran netværket. Vi bemærker, at enhver analyse af de mindste tats komponenter afhænger af farvningsprocedurer. Det er vores erfaring, 800 pi af en 50 pM di-8-ANEPPS løsning er tilstrækkelige til at plette komplette tats netværk i en pelleteret celle indeholdende 50.000 ^VM-9. Hvis cellepelleten indeholder et lavere antal hjertemyocytter, Hvis kraftige fluorescensdetektorer er til rådighed, og hvis konfokal billeddannelse af den samlede TATS distributionsnetværket snarere end mindste membran detaljer og kvantitative ændringer er af interesse, lavere farvestofkoncentrationer kan anvendes på grundlag af empirisk testning. Endelig kan en software makro udført for den beskrevne analyse anvendes til at automatisere billede bearbejdningstrin for at lette analyse af større datasæt, som er særlig anvendelig til sammenligning mellem forskellige behandlingsgrupper (fx lægemidler), celletyper (f.eks AM versus VM ) og patofysiologiske indgreb (f.eks fingeret versus myokardieinfarkt).

Til billedanalyse af tats netværk, vises følgende sekvens af principielle trin anvendt: 1) rullende bold baggrund-subtraktion (4.5.1) for at fjerne rumlige variationer i baggrunden intensitet; 2) forbedring lokal kontrast (4.5.2).; 3) billede udjævning (4.5.3); 4) statistisk område sammenlægning (4.5.4); 5) fastlæggelse aftærskel på billedet binarisering (4.5.6); og 6) beregning af skelettet data (4.5.8). Et kritisk trin under skeletonization af fluorescerende tats billeder er det billede binarisering vist i figur 6. De tilknyttede tærsklingsparametre trin i sidste ende definere, hvilke sande membranstrukturer detekteres at repræsentere de underliggende tats komponenter versus potentielt falske strukturer identificeret ved fejl fra baggrundsstøj. Identifikation af den korrekte tærskel for binære billede analyse bør svare til de sande TATS membranstrukturer, som afhænger af et tilstrækkeligt højt signal-til-støj (SNR) forholdet hver for konfokal og superresolution mikroskopi tilgange. Derfor bør en tilstrækkelig billedkvalitet etableres først og derefter kombineret med kritisk vurdering af de enkelte celle kvalitet, herunder dokumentation af lyse felt billeder som skitseret. Alternative muligheder for at tilpasse billedet segmentering protokol for en given mikroskop data output og / eller fysiological spørgsmål omfatter billede dekonvolution og andre tærsklingsparametre procedurer som "Otsu" eller "ISO-data" til rådighed som ImageJ plugins. Uanset den endelige segmentering proceduren, mener vi sammenligningen mellem udtrukne og rådata ved billedet overlay en obligatorisk kvalitetskontrol trin. Sammenfattende vil morfologiske og membran integritet enkelte isolerede myocytter, tilstrækkelig farvning af intracellulære tats membraner, parameter optimering for fluorescensimagografi, og overlay kontrol af ekstraherede skelet data alle bidrage til kvaliteten af ​​fluorescerende tats billeder og kvantitative resultater.

Hvis der anvendes større arter end musen til celleisolering kan protokollerne let tilpasses. For de næste større arter kan rottehjerter blive kanyle med en stump 14 G kanyle (ydre diameter 2,1 mm) og perfuseret ved 8 ml / min. Betydeligt ældre eller syge hjerte kan kræve endnu større kanylen størrelser. I genral cardiac perfusion udføres enten ved konstant tryk fx ved hjælp af en 1 m høj vandsøjle mellem reservoiret og aorta eller ved konstant strømning ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Til celleisolering fra små gnavere hjerter som mus og rotter konstant flow kan være fordelagtig, da collagenasefordøjelse sidst vil forstyrre koronare modstandskar fører til høje perfusion satser fra utætte fartøjets senge, som vil blive kontrolleret til en vis grad ved konstant flow protokoller. I modsætning hertil konstant pres perfusion er fordelagtigt, hvis overvågning af flow og korrekt kanylering er en prioritet, hvilket er fordelagtigt for interventionsmodeller med ændret blodkar modstand adfærd samt til uddannelse af celleisolering procedurer.

Som skitseret ovenfor, tilstrækkelig cellernes kvalitet er meget vigtigt for kvantitative undersøgelser af endogene membran-systemer. Men under hjerte perfusion og collagenasefordøjelse mange faktorer kan critically påvirke kvaliteten af cellen isolation, som aldrig bør undervurderes under protokol optimering eller fejlfinding ^27. Især bør aktiviteten af en given kollagenase parti bestemmes for det specifikke væv af interesse fx atrier eller ventrikler forud for fuldbyrdelsen af de eksperimentelle bona fide undersøgelser for at etablere isolation betingelser, der skal opretholdes i hele resten af undersøgelsen. Desuden vil vandkvalitet, pH, temperatur, optimering og rengøring af perfusionen setup minimere risikoen for utilsigtet skade fra forureninger og emboli, og potentielt yderligere faktorer skal overvåges for at etablere optimale homeostatiske forhold under celleisolering. BDM (2,3-butandion-monoxim) en reversibel inhibitor af myosin ATPase cross-broer er almindeligt anvendt i væv dissektion og fordøjelse at opretholde hjertemusklen afslapning, hvilket øger udbyttet af celle isoleringer. Alligevel efterforskere har brug for to være opmærksom på, at BDM kan udøve uspecifikke phosphatase aktiviteter, der fører til off-target effekter fx, hæmning af Na ⁺ / Ca ^{2 +} udveksle strømme under visse betingelser ^33. For nogle forsøg kan det være fordelagtigt at erstatte BDM ved Blebbistatin som cardioplegisk opløsning, en inhibitor med en høj affinitet for myosin i mikromolære koncentrationer, som er imidlertid toksiske og relativt dyre og kan have andre ikke-tilsigtede virkninger. Resting sunde cardiomyocytter bør ikke vise nogen sammentrækninger i fravær af elektrisk stimulation og sådanne celler bør udelukkes fra yderligere analyse. På den anden side, hjerte myocyt sammentrækning og afslapning som reaktion på elektrisk stimulation ved fysiologiske ekstracellulær Ca2 ⁺ koncentrationer kan anvendes til at fastsætte den normale kontraktile adfærd som en ekstra foranstaltning for at vurdere funktionel cellernes kvalitet og / eller unormal adfærd i hjertesygdomme versus raske kontrol celler.

<p class="Jove_content"> Sammenfattende har protokoller for enkelt celle isolering og kvantitativ billedanalyse beskrevet her held været anvendt ved konfokal og superresolution mikroskopi af TATS membran netværk i VM ⁹ og AM celler ²¹ samt til kvantitativ analyse af mikrotubuli netværk faste hjertemyocytter (data ikke vist). Disse og fremtidige anvendelse af de protokoller, kan åbne muligheder for en række eksperimentelle spørgsmål som karakteriseringen af ​​tats membraner på forskellige udviklingsstadier eller analyse af membran-associeret protein eller organel strukturer, der er i kontakt med TATS netværk til at udøve stærkt lokaliseret, domæne specifik signalering funktionerne i AM og VM celler.

Materials

Chemicals and enzymes
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	B0753
Bovine calf serum	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	SH30073	Triple 0.1 µm sterile filtered.
CaCl2	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	21115	Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.
Collagenase type II	Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany	on request	Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II  and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.
Glucose	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	HN06.1
Heparin	Rotexmedica, Trittau, Germany	PZN-03862340	Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.4
Forene 100% (V/V)	Abbott, Libertyville, IL, USA	B506	Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.3
KH2PO4	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3904.2
Laminin (2 mg/ml)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	354232	Lamination is described under step 2.1.
MgCl2 · 6 H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2189.2
MgSO4 · 7 H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8283.2
Na2HPO4 · 2 H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4984.2
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	HN01.1
Taurin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS	Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany	D-3167	Stock solution 2 mM in DMSO
Trypan blue	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	T8154	Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.
Langendorff perfusion setup
Circulation thermostat	Lauda, Lauda-Königshofen, Germany		Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use.
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump	VWR, Darmstadt, Germany	224-2252	Tubing needs to be changed regularly.
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat	VWR, Darmstadt, Germany	228-4340
Heating coil surroundung perfusion tubing	Rettberg, Göttingen, Germany	custom-made	Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly  in 10 mM NaOH overnight.
Peristaltic pump	Ismatec, Wertheim, Germany	ISM830
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm	Braun, Melsungen, Switzerland	16500C
Three way stop cock Discofix 3SC	Braun, Melsungen, Switzerland	4095146
Instruments
42 mm glass coverslips	Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany	on request	0.13 – 0.16 mm thickness
Cannula 21G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA	304432	Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm	Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany	on request	0.38 – 0.42 mm thickness
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11151-10
LSM 710 NLO	Carl Zeiss, Jena, Germany		63x 1.4 NA oil objective
Neubauer improved cytometer	Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany	1100000	Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.
POC-R2 Imaging Chamber	Pecon, Erbach, Germany		Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15025-10
Student dumont #7 forceps, inox	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91197-00
Student iris scissors, curved, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91461-11
Student iris scissors, straight, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91460-11
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91402-12
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11023-10