I hjertemyocytter, rørformede membran strukturer danner intracellulære netværk. Vi beskriver optimerede protokoller for i) isolering af myocytter fra mus hjerte, herunder kvalitetskontrol, ii) levende celler farvning for state-of-the-art fluorescens mikroskopi, og iii) direkte billede analyse til beregning af komplekse komponenter og plasticitet intracellulær membran netværk.
In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.
Hos raske tværstribede muskelceller, rørformede membran strukturer med "tværgående" orienteringer (T-tubuli) vinkelret på de vigtigste celle-aksen er rigelige. Derfor har T-tubuli blevet karakteriseret som løbende udvidelser af muskelcellen vigtigste "lateral" overflade membran (sarcolemma), der dybt trænge ind i cytosolen mod midten af cellen. Den fysiologiske rolle af T-tubuli kontinuerlige med den ydre overflade membran er den hurtige elektriske kobling af fjerntliggende intracellulære rum dannet ved SER organel kontakt domæner i hele den relativt store hjertemuskel cellevolumen af nanometriske nærhed kobling af spænding-aktiverede L type Ca2 + kanaler (Cav1.2) indad (I Ca) aktivering tilstødende ryanodine receptor (RyR2) SER Ca 2 + udgivelser. I ventrikelmyocytter (FOS), de ikke-løbende kontakter membran ("kryds") mellem forbindelsesepitop SER domæner og T-tubules menes at kontrollere tusinder af individuelle intracellulære Ca2 + release nanodomains i hver celle 1.
For en given kontakt domæne, de sammenstillede membran portioner af hver af T-tubulus og perifere (forbindelsesepitop) SER er cirka 15 nm tæt på hinanden, og derfor defineret som nanodomain. Derved er meget små individuelle cytoplasmatiske underrum adskilt som muligt kvasi celle-autonome rum adfærd. Når et indgående handling potentiale aktiverer Cav1.2 kanaler i t-tubuli VM'er, en relativt lille Ca 2 + indad strøm vil stige hurtigt underrummet Ca 2 + koncentration [Ca 2 +] S i attoliter størrelse nanodomain 1. Dernæst [Ca 2 +] S stigning aktiverer Ca2 + -gated ryanodine receptorer (RyR2) inden nanometer nærhed i sidestillede SER membranen vejkryds, og denne kobling proces sker gennem hele elektrisk pard myocyt nanodomains. RyR2s forekommer som tætte multi-kanal klynger med en anslået støkiometri af 1 Cav1.2 kanal for 5-10 RyR2 kanaler 2. Da SER-til-cytosolen [Ca2 +] gradient er meget stejle (forholdet 10 4: 1) og RyR2s fungere som high-konduktans Ca2 + release kanaler i funktionelt koblede klynger RyR2 aktivering resulterer i en kvantitativt stor Ca2 + frigive strøm fra T-tubulus koblede forbindelsemotiver SER domæner stigende lokal underrum [Ca2 +] S til 100 um eller højere inden for 1-2 msek 3,4. Denne cardiac signalforstaerkning opførsel er også kaldet Ca 2 + induceret Ca2 + frigivelse (CICR). Tilsammen T-tubuli er væsentlige membranstrukturer der hurtigt aktiverer Ca2 + release signaler gennem forbindelsemotiver nanodomain SER kontakter og celle-dækkende CICR under excitation-kontraktion (EF) kobling.
Ud over T-tubuli, aksial tubuluss (A-tubuli) med en markant anderledes retning parallelt med de vigtigste (langsgående) celle akse er blevet dokumenteret ved elektronmikroskopi (EM), konfokal og 2-foton mikroskopi studier. For eksempel blev en celle-dækkende kontinuerlig gitter af A-tubuli mellem myofibriller sammenkoblet med T-tubuli nær sarkomeret Z-linier vist med ekstracellulære sporstoffer og EM billeddannelse af fast marsvin VM'er 5. Brug af ekstracellulær dextran-bundet fluorescein farvning og leve 2-foton billeddannelse af rotte VM'er blev en kompleks retikulær 3D tubulus netværk visualiseret bestående af ~ 60% T-tubuli og ~ 40% A-tubuli 6. Denne undersøgelse ikke kun ført til 3D-visualisering af rigelige A-tubuli, men også til den erkendelse, at sektionering EM-visualisering er ifølge sagens natur begrænset til analyse af komplekse og dynamiske membran netværk som den tværgående-aksial tubulus systemet (TATS). Følgelig konfokal levende celler billeddannelse af tats membraner direkte farvet med di-8-ANNEPS blev udviklet. Hvis levende celleTats netværk analyseres ved Fourier transformation, er regelmæssig udseende T-tubulus komponenter i rummet nær sarkomeret Z-linjer afspejles af ensemblet magt spektret fra en region i tværstribede signaler 7. Denne indirekte analyse strategi har været anvendt til at detektere celle-dækkende regionale ændringer i TATS komponent regelmæssighed i sygdomsmodeller 7. For eksempel shRNA medieret junctophilin-2 knock-down forårsagede hjertesvigt og isoformspecifik proteinmangel resulterede i T-tubuli reorganisering med nanodomain Ca 2 + frigivelse dysfunktion 8. Vi har for nylig udvidet analyse af tats membran netværk gennem direkte kvantitative metoder og yderligere ved levende celle superresolution mikroskopi af individuelle tats komponenter i mus VMs ved hjælp af stimuleret emission depletion (STED) Nanoscopy 9. Nanometrisk billedopløsning tilladt for direkte analyse af mindre individuel tats komponenter, som tilnærme en 50:50 fordeling af tværgåendeversus aksiale tubulære orienteringer kvantitativt bekræfter to rigelige endnu differentielt orienterede individuelle tats komponenter i raske mus hjerter 9. Disse strategier vil blive yderligere beskrevet i protokol nedenfor.
Mens den fysiologiske rolle af de rigelige A-tubulære komponenter i den voksne hjerte er forblevet gådefuld, har EM-undersøgelser dokumenteret membranstrukturer SER forbundet med A-tubuli tyder endogene Ca2 + release nanodomains i marsvin og rotter VMs 5,10. Konfokal analyse af Cav1.2 og RyR2 fandt en høj grad af co-lokalisering på A-tubulære kryds 10. Da ~ 20% af spontane Ca 2 + gnister i rotte VM'er opstod relativt langt væk fra Z-line riller, hvor T-tubuli typisk forekommer, har ét argument været, at faktisk kan eksistere og funktion A-tubulus associerede nanodomains som Ca 2 + frigivelse sites 11,12. Interessant T-tubulusdannelse og modning ockøtere kun efter fødslen og paralleller væksten af hjerteceller, fx gennem spiring af forstadie sarcolemmal invaginationer på P5 og umodne forgrenede TATS netværk forsamlinger på P10 i mus 13. Det fremgår, at Junctophilin-2 er særligt vigtigt for postnatal TATS netværk modning siden shRNA knock-down forhindrede forankring af T-tubulære membraner til SER vejkryds fører til forsinket Ca2 + frigivelse og patologisk TATS organisation i overensstemmelse med umodne A-tubulus domineret arkitekturer i VMs 13. Disse observationer kan i sidste ende føre til proof-of-concept, som T-tubuli dannes gennem membranen indkrængning processer, mens A-tubuli kan morph gennem yderligere eller endda alternative intracellulære mekanismer 14.
Karakterisering af naturlige levesteder membran ændringer i hjertesygdom er blevet et vigtigt forskningsområde for patofysiologiske spørgsmål. De første rapporter i en hund model af pacing-induceret hjerte failure viste et underskud på T-tubuli og Cav1.2 strøm (I Ca) 15. En gris model af iskæmisk kardiomyopati viste nedsat T-tubulus tætheder og et reduceret synkroni af intracellulært Ca2 + frigive 16. Ved hjælp af en spontant hypertensiv rotte (SHR) model for hjertesvigt, blev et tab på T-tubuli forbundet med reduceret nanodomain kobling af Cav1.2 og RyR2 af den foreslåede mekanisme "RyR2 forældreløst" 7. Et tab af T-tubuli er også blevet vist i human VM'er fra iskæmiske, udvidede og hypertrofisk kardiomyopati prøver 17. Desuden blev en stigning i A-tubuli rapporteret i vævssnit af human dilateret kardiomyopati 18. Efter myokardieinfarkt viste vi en differentieret mekanisme TATS reorganisering i mus VM'er med betydelige fald i T-tubuli i modsætning til stigninger på A-tubulære komponenter 9. Vigtigere, forbedret lokal membran kontrast opnås gennem levende celle superreløsning STED mikroskopi aktiveret detaljeret kvantitativ komponent analyse gennem direkte målinger, som viste betydelig spredning af A-tubuli med generelle stigninger i længde TATS nettet og forgrener kompleksitet 9. Desuden blev det vist, at træningen kan omvendt T-tubulus remodeling hos rotter efter myokardieinfarkt 19 og at kardiel resynkroniseringsterapi kan føre til at vende ombygning af T-tubuli hunde med atrial tachypacing induceret hjertesvigt 20. Tilsammen vil undersøgelser både i syge mennesker og dyr VM'er samt potentielle terapeutiske interventioner velsagtens gavn af høj kvalitet celleisolering procedurer og detaljerede strategier kvantitativ analyse som beskrevet i protokollen og resultater afsnittene nedenfor.
Som demonstreret for nylig af laterale overflade versus TATS membran handel med KATP kanal isoformer 21, er det vigtigt at overveje atrial myocytes (AMS) som biologisk distinkt samt sammenlignende kardiel celle model versus FOS. T-tubuli blev for nylig dokumenteret i får og menneskelig AMS 22. Aktuelt tyder på, at få T-tubuli findes i AM-celler og typisk i større pattedyr som får og mennesker, men ikke i små gnavere 23. I modsætning til VM'er i AMS intracellulær Ca2 + frigivelse synes at forekomme fra celleoverfladen udbreder ved diffusion i retning af midten af cellen, hvilket resulterer i markant rumlige og tidslige Ca2 gradienter 23. Inden for denne ramme forekommer vigtigt at belyse mekanismerne i intracellulær Ca2 + signalering ustabilitet for almindelig sygdom former, såsom atrieflimren 24. Sammenfattende er både AM og VM celleisolering og hver for sunde og syge hjerter almindeligt anvendte protokoller. Kun hvis celleisolering er gjort ordentligt som bedømt ved mikroskopisk dokumentation af tilstrækkelig cellernes kvalitet, bør AM og VM prøver være carried fremad for kvantitativ TATS analyse. Følgelig Følgende protokol afsnit er kritisk afhængige af høj kvalitet celle isolater fra mus eller andre arter, efterfulgt af levende celler mikroskopi til at analysere intakte tats membraner. Som påpeget tidligere, karakterisering af tats membraner er en udfordrende forskningsområde med en tilbøjelighed til fiksering og præparationsfejl 6, ændringer membran følge osmotiske forandringer og begrænsninger af konventionel lysmikroskopi 9 opløsning. Vi bemærker, at de seneste state-of-the-art-protokoller til isolering af humane AMS for Ca 2 + billedbehandling og patch-clamp og rotte VMs til celledyrkning er tidligere blevet offentliggjort i dette tidsskrift 25,26.
Selv hjertemyocytter er blevet isoleret og undersøgt i årtier 32 indgik en nylig gennemgang, at der konsekvent høj kvalitet myocyt celle isolationer forbliver udfordrende 27. Dette afspejler forholdsvis komplekse protokoller for isolering af primære hjertemyocytter vis-a-vis en mangel på fælles standard fremgangsmåder, fælles metadata og gennemskuelig dokumentation cellernes kvalitet. Celleisoleringen protokoller er normalt tilpasset af enkelte grupper, give variable resultater af celle-isolater, afhænger af de konkrete model indstillinger (f.eks art, alder, sameksisterende hjertesygdomme), og er normalt korrigeret for særlige eksperimentelle betingelser. Inden for rammerne af den kvantitative TATS membran studier og protokoller, der præsenteres her, en væsentlig grad af skøn og dokumentation kvalitet vedrører konfokal eller superresolution mikroskopi af individuelle celle membranstrukturer tilbøjelige til metaboliske og isolation protokol afhængige forandringer, bådei AM eller VM. Vigtigere er det, selv om høje udbytter af celle isolater tyder sund og intakt myocytes nødt efterforskere til at dokumentere og kritisk vurdering af de enkelte celle omhyggeligt mod morfologiske kriterier overflade og TATS membran integritet versus ikke-specifik skade på grund af isolationsprocedurer versus specifikke ændringer som følge af forskellige typer af interventioner i forhold til at styre betingelser. En vigtig variabel under hjerteiskæmi celleisolering er den specifikke aktivitet af et givet kollagenase parti. Sådan vælger du et nyt lot collagenase, bør den enzymatiske aktivitet af flere kollagenase testes mod hinanden ved at vurdere hjertefunktionen myocyt udbytte og kvalitet, og i overensstemmelse med producentens anvisninger. Ideelt set et nyt lot collagenase identificeret med collagenase aktivitet svarende til de tidligere med held anvendte partier (for udvidet evaluering af mulige enzymaktiviteter se "collagenase parti markeringsværktøjet" i materialer og metoder tabel). Taken sammen, kvantitative metoder i TATS membran visualisering afhænger kritisk celleisolering kvalitet, og omvendt, hjerte celle isolationer fører til uspecifik skade membran, som dokumenteret af TATS mikroskopi bør udløse kritisk gennemgang og korrektion af isolation procedurer. Da celleisolering kvalitet og TATS membran visualisering og kvantificering er uløseligt forbundet, protokollerne omtales i denne artikel dækker alle større aspekter som en kontinuerlig strategi.
En yderligere udfordring og fælles problem af hjerte undersøgelser, celleskader og / eller celler tab opstår på grund af metabolisk kompromitterende interventioner fx, efter myokardieinfarkt 9, men skal vurderes i forhold til potentiel utilsigtet skade fx efter ubemærket luftembolisme under celleisolering. Isolering af hjertemyocytter fra syge hjerter kan føre til yderligere, betydelige tab celle og nedsat celleudbytter. Derfor sammenlignelighedmenligning af det samlede antal af isolerede intakte celler mellem kontrol og syge hjerter kan være meningsfuld, hvis celle isolering og tælling anvendes konsekvent gennem standardiserede protokoller. Derfor er det vigtigt at bedømme celleintegritet gennem en passende kontrolgruppe, hvilket afspejler den bedst mulige myocytcellestørrelse isolation kvalitet. Vigtigere, individuel celle kvalitet og levende celler mikroskopi af sunde versus syge versus myocytter uforvarende beskadiget af isolation procedure kan influere betydeligt på analysen af tats membran netværk. De protokoller, der præsenteres her derfor understrege integritet og stabilitet fysiologiske membran komponenter under celleisolering og levende celler mikroskopi af intakte membraner. Hele arbejdsgangen er udformet som en kontinuerlig strategi for at opnå og bevare intakte TATS membrankomponenter samtidig at udelukke beskadigede celler, da disse vil udstille isolation afhængige membran artefakter som sprængte membran tubuli membrane blærer og ændrede tats netværk fejlagtigt under kontrol betingelser og kompromittere yderligere kvantitativ analyse. Omvendt er de samme strategier er afgørende for interventionsstudier med potentiale til at forstyrre tats membraner, der afhænger kritisk på meningsfulde kontrol sammenligning mellem sandt sund versus ægte syge celle med tats membran ændringer.
Derudover har vi fat procedurer for at opnå den teknisk meget mere udfordrende isolering af AM-celler. Trods fremskridt og forbedrede protokoller, er det vigtigt at understrege, at det er ikke trivielt at gengive høj kvalitet celle isoleringer af VM'er og endnu mindre pålidelige for AMS. Dette skyldes, at den generelle lavere udbytte af AM-celler, hvor selv små fejl eller variationer i løbet celleisolering kan føre til at fuldføre fiasko AM celleisolering, mens en mild grad af VM celleskader kan være mindre synlige i celle suspension følge af relativt høje celle tal i forhold til AM. Da AM-celler kan blive curved efter isolering, kan analysen gennem flere ROIs være en fordel som skitseret i trin 4.3. Efter en detaljeret procedure for celleisolering trin, giver vi en protokol for direkte integreret membranfarvning og konfokal eller STED superresolution billeddannelse af tats netværk både VM'er og AMS. Disse protokoller gør det muligt både kvantitativ analyse og differentiering af udvalgte komponenter af tats membraner gennem tidligere fastsatte parametre. I forhold til VM'er, 3D-organisationen og funktionelle adfærd af den atrielle TATS netværk i AMS er i øjeblikket mindre forstået.
Procedurerne til billedet tats membraner i levende celler (trin 3.1 til 3.7) blev udviklet med kommerciel konfokal (Table of Materials / udstyr) og skræddersyede STED fluorescens mikroskoper 9. For at optimere mikroskop indstillingerne for fluorescerende billeddannelse og kvantitativ TATS analyse, er følgende punkter af generel betydning:
I modsætning til de strategier direkte analyse præsenteres her, tidligere publikationer, der beskriver tats membraner og sygdomsrelaterede ændringer, har brugt regionale aggregerede udlæsninger af T-tubulus massefylde som kvantitativ strategi 16,17 eller indirekte regionale strategier baseret på Fourier Transfsninger analyse af tværstribede membran signaler for at vurdere T-tubulus komponent regelmæssighed 7. I modsætning hertil er de kvantitative metoder, der beskrives her direkte relateret til de enkelte tats komponenter, og giver en række yderligere parametre, herunder membran netværk egenskaber og specifikke komponenter som den procentdel af A-tubuli. Endvidere kan TATS netværk tæthed kvantificeret som den normaliserede længde af hele ekstraheret skelet pr ROI område. Antallet af tredobbelt kryds af tre enkelte, kan kontinuerligt forbundet tubulære komponenter anvendes som et mål for den forgrening kompleksitet TATS membran netværket. Vi bemærker, at enhver analyse af de mindste tats komponenter afhænger af farvningsprocedurer. Det er vores erfaring, 800 pi af en 50 pM di-8-ANEPPS løsning er tilstrækkelige til at plette komplette tats netværk i en pelleteret celle indeholdende 50.000 VM-9. Hvis cellepelleten indeholder et lavere antal hjertemyocytter, Hvis kraftige fluorescensdetektorer er til rådighed, og hvis konfokal billeddannelse af den samlede TATS distributionsnetværket snarere end mindste membran detaljer og kvantitative ændringer er af interesse, lavere farvestofkoncentrationer kan anvendes på grundlag af empirisk testning. Endelig kan en software makro udført for den beskrevne analyse anvendes til at automatisere billede bearbejdningstrin for at lette analyse af større datasæt, som er særlig anvendelig til sammenligning mellem forskellige behandlingsgrupper (fx lægemidler), celletyper (f.eks AM versus VM ) og patofysiologiske indgreb (f.eks fingeret versus myokardieinfarkt).
Til billedanalyse af tats netværk, vises følgende sekvens af principielle trin anvendt: 1) rullende bold baggrund-subtraktion (4.5.1) for at fjerne rumlige variationer i baggrunden intensitet; 2) forbedring lokal kontrast (4.5.2).; 3) billede udjævning (4.5.3); 4) statistisk område sammenlægning (4.5.4); 5) fastlæggelse aftærskel på billedet binarisering (4.5.6); og 6) beregning af skelettet data (4.5.8). Et kritisk trin under skeletonization af fluorescerende tats billeder er det billede binarisering vist i figur 6. De tilknyttede tærsklingsparametre trin i sidste ende definere, hvilke sande membranstrukturer detekteres at repræsentere de underliggende tats komponenter versus potentielt falske strukturer identificeret ved fejl fra baggrundsstøj. Identifikation af den korrekte tærskel for binære billede analyse bør svare til de sande TATS membranstrukturer, som afhænger af et tilstrækkeligt højt signal-til-støj (SNR) forholdet hver for konfokal og superresolution mikroskopi tilgange. Derfor bør en tilstrækkelig billedkvalitet etableres først og derefter kombineret med kritisk vurdering af de enkelte celle kvalitet, herunder dokumentation af lyse felt billeder som skitseret. Alternative muligheder for at tilpasse billedet segmentering protokol for en given mikroskop data output og / eller fysiological spørgsmål omfatter billede dekonvolution og andre tærsklingsparametre procedurer som "Otsu" eller "ISO-data" til rådighed som ImageJ plugins. Uanset den endelige segmentering proceduren, mener vi sammenligningen mellem udtrukne og rådata ved billedet overlay en obligatorisk kvalitetskontrol trin. Sammenfattende vil morfologiske og membran integritet enkelte isolerede myocytter, tilstrækkelig farvning af intracellulære tats membraner, parameter optimering for fluorescensimagografi, og overlay kontrol af ekstraherede skelet data alle bidrage til kvaliteten af fluorescerende tats billeder og kvantitative resultater.
Hvis der anvendes større arter end musen til celleisolering kan protokollerne let tilpasses. For de næste større arter kan rottehjerter blive kanyle med en stump 14 G kanyle (ydre diameter 2,1 mm) og perfuseret ved 8 ml / min. Betydeligt ældre eller syge hjerte kan kræve endnu større kanylen størrelser. I genral cardiac perfusion udføres enten ved konstant tryk fx ved hjælp af en 1 m høj vandsøjle mellem reservoiret og aorta eller ved konstant strømning ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Til celleisolering fra små gnavere hjerter som mus og rotter konstant flow kan være fordelagtig, da collagenasefordøjelse sidst vil forstyrre koronare modstandskar fører til høje perfusion satser fra utætte fartøjets senge, som vil blive kontrolleret til en vis grad ved konstant flow protokoller. I modsætning hertil konstant pres perfusion er fordelagtigt, hvis overvågning af flow og korrekt kanylering er en prioritet, hvilket er fordelagtigt for interventionsmodeller med ændret blodkar modstand adfærd samt til uddannelse af celleisolering procedurer.
Som skitseret ovenfor, tilstrækkelig cellernes kvalitet er meget vigtigt for kvantitative undersøgelser af endogene membran-systemer. Men under hjerte perfusion og collagenasefordøjelse mange faktorer kan critically påvirke kvaliteten af cellen isolation, som aldrig bør undervurderes under protokol optimering eller fejlfinding 27. Især bør aktiviteten af en given kollagenase parti bestemmes for det specifikke væv af interesse fx atrier eller ventrikler forud for fuldbyrdelsen af de eksperimentelle bona fide undersøgelser for at etablere isolation betingelser, der skal opretholdes i hele resten af undersøgelsen. Desuden vil vandkvalitet, pH, temperatur, optimering og rengøring af perfusionen setup minimere risikoen for utilsigtet skade fra forureninger og emboli, og potentielt yderligere faktorer skal overvåges for at etablere optimale homeostatiske forhold under celleisolering. BDM (2,3-butandion-monoxim) en reversibel inhibitor af myosin ATPase cross-broer er almindeligt anvendt i væv dissektion og fordøjelse at opretholde hjertemusklen afslapning, hvilket øger udbyttet af celle isoleringer. Alligevel efterforskere har brug for to være opmærksom på, at BDM kan udøve uspecifikke phosphatase aktiviteter, der fører til off-target effekter fx, hæmning af Na + / Ca 2 + udveksle strømme under visse betingelser 33. For nogle forsøg kan det være fordelagtigt at erstatte BDM ved Blebbistatin som cardioplegisk opløsning, en inhibitor med en høj affinitet for myosin i mikromolære koncentrationer, som er imidlertid toksiske og relativt dyre og kan have andre ikke-tilsigtede virkninger. Resting sunde cardiomyocytter bør ikke vise nogen sammentrækninger i fravær af elektrisk stimulation og sådanne celler bør udelukkes fra yderligere analyse. På den anden side, hjerte myocyt sammentrækning og afslapning som reaktion på elektrisk stimulation ved fysiologiske ekstracellulær Ca2 + koncentrationer kan anvendes til at fastsætte den normale kontraktile adfærd som en ekstra foranstaltning for at vurdere funktionel cellernes kvalitet og / eller unormal adfærd i hjertesygdomme versus raske kontrol celler.
<p class="Jove_content"> Sammenfattende har protokoller for enkelt celle isolering og kvantitativ billedanalyse beskrevet her held været anvendt ved konfokal og superresolution mikroskopi af TATS membran netværk i VM 9 og AM celler 21 samt til kvantitativ analyse af mikrotubuli netværk faste hjertemyocytter (data ikke vist). Disse og fremtidige anvendelse af de protokoller, kan åbne muligheder for en række eksperimentelle spørgsmål som karakteriseringen af tats membraner på forskellige udviklingsstadier eller analyse af membran-associeret protein eller organel strukturer, der er i kontakt med TATS netværk til at udøve stærkt lokaliseret, domæne specifik signalering funktionerne i AM og VM celler.The authors have nothing to disclose.
This work received support through Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (subprojects A05 and B05 to S.E.L.) and KFO 155 (subproject 4 to S.E.L.), a Halbach Foundation award to S.E.L. supporting E.W.; a grant from the German Cardiac Society to S.B.; and a DAAD exchange program supporting T.K. as visitor at the University of Maryland. The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement No. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (to S.E.L.). S.E.L. is a principal investigator of the German Center of Cardiovascular Research (DZHK).
Chemicals and enzymes | |||
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | B0753 | |
Bovine calf serum | Thermo Scientific, Schwerte, Germany | SH30073 | Triple 0.1 µm sterile filtered. |
CaCl2 | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 21115 | Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration. |
Collagenase type II | Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany | on request | Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase. |
Glucose | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN06.1 | |
Heparin | Rotexmedica, Trittau, Germany | PZN-03862340 | Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin. |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.4 | |
Forene 100% (V/V) | Abbott, Libertyville, IL, USA | B506 | Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument. |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.3 | |
KH2PO4 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3904.2 | |
Laminin (2 mg/ml) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 354232 | Lamination is described under step 2.1. |
MgCl2 · 6 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | |
MgSO4 · 7 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8283.2 | |
Na2HPO4 · 2 H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.2 | |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HN01.1 | |
Taurin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4721.2 | |
Dyes | |||
Di-8-ANEPPS | Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany | D-3167 | Stock solution 2 mM in DMSO |
Trypan blue | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | T8154 | Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer. |
Langendorff perfusion setup | |||
Circulation thermostat | Lauda, Lauda-Königshofen, Germany | Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use. | |
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump | VWR, Darmstadt, Germany | 224-2252 | Tubing needs to be changed regularly. |
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat | VWR, Darmstadt, Germany | 228-4340 | |
Heating coil surroundung perfusion tubing | Rettberg, Göttingen, Germany | custom-made | Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly in 10 mM NaOH overnight. |
Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim, Germany | ISM830 | |
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm | Braun, Melsungen, Switzerland | 16500C | |
Three way stop cock Discofix 3SC | Braun, Melsungen, Switzerland | 4095146 | |
Instruments | |||
42 mm glass coverslips | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.13 – 0.16 mm thickness |
Cannula 21G | Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA | 304432 | Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper. |
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm | Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany | on request | 0.38 – 0.42 mm thickness |
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11151-10 | |
LSM 710 NLO | Carl Zeiss, Jena, Germany | 63x 1.4 NA oil objective | |
Neubauer improved cytometer | Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany | 1100000 | Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts. |
POC-R2 Imaging Chamber | Pecon, Erbach, Germany | Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM | |
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15025-10 | |
Student dumont #7 forceps, inox | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91197-00 | |
Student iris scissors, curved, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91461-11 | |
Student iris scissors, straight, 11.5 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91460-11 | |
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 91402-12 | |
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11023-10 |