Analyse van buisvormig membraan Netwerken in hartspiercellen van boezems en kamers

Summary

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

Abstract

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules – the transverse-axial tubule system (TATS) – controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca²⁺ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

Introduction

In gezonde dwarsgestreepte spiercellen, buisvormige membraan structuur met "dwars" oriëntaties (T-tubuli) loodrecht op de hoofdleiding cel as zijn overvloedig. Dientengevolge hebben T-tubuli gekenmerkt als continue uitbreidingen van de spiercel main "lateraal" oppervlak membraan (sarcolemma), die diep doordringen in de cytosol naar het celcentrum. De fysiologische rol van T-tubuli continu met het buitenoppervlak membraan snelle elektrische koppeling van externe intracellulaire compartimenten gevormd door SER organel contact domeinen gehele relatief grote hartspiercel volume nanometrische nabijheid koppeling van voltage-geactiveerde L-Ca2 ⁺ kanalen (Cav1.2) naar binnen (I _Ca) activeren van aangrenzende ryanodinereceptor (RyR2) SER Ca ^{2 +} releases. In hartspiercellen (VM's), de niet-continue membraan contacten ("knooppunten") tussen de junctionele SER domeinen en T-tubules wordt gedacht dat duizenden individuele intracellulaire Ca2 ⁺ afgifte nanodomains controle in elke cel ^1.

Voor elk contact domein, de naast elkaar geplaatste gedeelten membraan elk van de T-tubuli en perifere (junction) SER ongeveer 15 nm dicht bij elkaar, dus gedefinieerd als nanodomain. Daarbij worden zeer kleine individuele cytoplasma deelruimten gescheiden die quasi-cel-autonome compartiment gedrag mogelijk te maken. Bij een inkomende actiepotentiaal activeert Cav1.2 kanalen in de T-tubuli van VM's, een relatief kleine Ca ^{2 +} naar binnen lopende zal snel toenemen de deelruimte Ca ^{2 +-concentratie} [Ca ^{2 +]} _S in de attoliter formaat nanodomain ^1. Vervolgens wordt de [Ca ^{2 +]} _S toename activeert Ca ^{2 +} -Gated ryanodine receptoren (RyR2) binnen nanometer nabijheid in het naast elkaar SER membraan knooppunt, en deze koppeling proces gebeurt in alle elektrisch paard myocyte nanodomains. RyR2s voorkomen als dichte multikanaals clusters voor een stoïchiometrie van 1 Cav1.2 kanaal 5-10 RyR2 kanalen ^2. Aangezien de SER naar cytosol [Ca2 ^+] gradiënt zeer steil (10 verhouding ^4: 1) en RyR2s gefunctioneerd als high-geleiding Ca2 ⁺ afgifte kanalen functioneel gekoppelde clusters, RyR2 activatie resulteert in een kwantitatief grote Ca2 ⁺ los stroom van T-tubulus gekoppeld junctional SER domeinen toenemende lokale deelruimte [Ca ^{2 +]} _S tot 100 uM of hoger binnen 1-2 msec ^3,4. Dit cardiale signaal amplificatie gedrag wordt ook wel Ca2 ⁺ geïnduceerde Ca2 ⁺ afgifte (CICR). Samen genomen, de T-tubuli zijn essentieel membraan structuur die snel activeren Ca ^{2 +} vrijlating signalen via junctional nanodomain SER contacten en cel-breed CKP tijdens excitatie-contractie (EC) koppeling.

Naast T-tubuli axiaal buisjes (A-tubules) met een significant verschillende oriëntatie parallel aan de hoofd (langs) as cellen werden gedocumenteerd door elektronenmicroscopie (EM), confocale en 2-foton microscopie studies. Bijvoorbeeld, een cel gehele continue rooster van A-tubules tussen myofibrils verbonden met T-tubuli dichtbij sarcomeer Z-lijnen werd getoond door extracellulaire tracers en EM beeldvorming van vaste cavia VM ^5. Met behulp van extracellulaire-dextran gekoppeld fluoresceïneverkleuring en live 2-foton beeldvorming van rat VM's, werd een complex reticular 3D tubulus netwerk gevisualiseerd bestaande uit ~ 60% T-tubuli en ~ 40% A-buisjes ^6. Deze studie niet alleen geleid tot 3D visualisatie van overvloedige A-tubules, maar ook tot het besef dat snijden voor EM visualisatie is inherent beperkt de analyse van complexe en dynamische membraan netwerken zoals de dwarse coaxiale tubulus systeem (TATS). Bijgevolg confocale live cell imaging van TATS membranen direct gekleurd met di-8-ANNEPS werd ontwikkeld. Als levende cellenTATS netwerken worden geanalyseerd door Fourier transformatie, wordt de regelmatige verschijning van T-tubulus componenten in de ruimte in de buurt van sarcomeer Z-lijnen weerspiegeld door het ensemble vermogensspectrum van een regio van dwarsgestreepte signalen ^7. Deze indirecte analyse strategie werd gebruikt om cel-grote regionale veranderingen in TATS component regelmatigheid detecteren ziektemodellen ^7. Zo shRNA gemedieerde junctophilin-2 afbraakprijzen veroorzaakt hartfalen en de isovorm specifiek eiwit tekort resulteerde in T-tubulus reorganisatie met nanodomain Ca ^{2 +} vrijlating dysfunctie ^8. We hebben onlangs uitgebreid de analyse van TATS membraan netwerken door middel van directe kwantitatieve benaderingen en verder door levende cellen superresolutiemicroscopie van individuele TATS componenten in de muis VM's met behulp van gestimuleerde emissie uitputting (STED) nanoscopie ^9. Nanometrische beeldresolutie toegestaan ​​voor een directe analyse van kleinere individuele TATS componenten, die een 50:50 verdeling van transversale benaderingversus axiale tubulus oriëntaties, kwantitatief bevestigen twee overvloedige nog verschillend georiënteerde individuele TATS componenten in gezonde muizen harten ^9. Deze strategieën zullen verder worden beschreven in de rubriek onderstaande protocol.

Terwijl de fysiologische rol van de overvloedige A-tubulus componenten in het volwassen hart raadselachtig is gebleven, hebben EM studies SER membraan structuren geassocieerd met A-buisjes suggereert endogene Ca ^{2 +} vrijlating nanodomains in cavia en rat VMs ^5,10 gedocumenteerd. Confocale analyse van Cav1.2 en RyR2 vond een hoge colocalization op A-tubulus kruispunten ^10. Aangezien ~ 20% spontane Ca2 ⁺ vonken in rat VM ontstaan ​​relatief ver van Z-lijn strepen waarbij T-tubuli typisch voorkomen, is een argument is dat A-tubulus geassocieerde nanodomains inderdaad bestaan ​​en functioneren als Ca ^{2 +} versieplaatsen ^11,12. Interessant is dat T-tubulus vorming en rijping occurs pas na de geboorte en loopt parallel met de groei van cardiale cellen, bijvoorbeeld door het kiemen van voorloper sarcolemmale invaginations op P5 en onvolwassen vertakt TATS netwerk samenstellingen bij een P10 bij muizen ^13. Het blijkt dat Junctophilin-2 is bijzonder belangrijk voor postnatale maturatie TATS netwerk aangezien shRNA neerhalen verhinderde de verankering van T-tubuli membranen SER knooppunten leidt tot vertraagde Ca2 ⁺ afgifte en pathologische TATS organisatie overeenstemming met onrijpe A-tubulus gedomineerd architecturen VM ^13. Deze waarnemingen kunnen uiteindelijk leiden tot proof-of-concept dat T-buisjes te vormen door middel van membraan invaginatie processen, terwijl A-buisjes kan morph door aanvullende of zelfs alternatieve intracellulaire mechanismen ^14.

Karakterisering van TATS membraan veranderingen in hart-en vaatziekten is uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied voor pathofysiologische vragen. De eerste berichten in een hond model van pacing-geïnduceerde hart failure toonde een verlies van T-tubuli en Cav1.2 (I _Ca) ^15. Een varken van ischemische cardiomyopathie vertoonden verminderde T-tubulus dichtheden en een verminderd synchronie van intracellulaire Ca ^{2 +} los ^16. Met behulp van een spontaan hypertensieve rat (SHR) van hartfalen, een verlies van T-tubuli werd geassocieerd met een verminderde nanodomain koppeling van Cav1.2 en RyR2 door het voorgestelde mechanisme van "RyR2 orphaning" ^7. Een verlies van T-tubuli is ook aangetoond in humane VM ischemische, verwijde, en hypertrofische cardiomyopathie monsters ^17. Bovendien, een toename A-buisjes werd gerapporteerd in weefselcoupes van menselijke gedilateerde cardiomyopathie ^18. Na een myocardinfarct, toonden we een differentiële mechanisme van TATS reorganisatie in muis VM's met een significante afname van de T-tubuli in tegenstelling tot een toename van de A-tubulus onderdelen ^9. Belangrijker nog, verbeterde lokale membraan contrast bereikt door levende cellen superreoplossing STED microscopie ingeschakeld gedetailleerde kwantitatieve elementanalyse door directe metingen, die aanzienlijke proliferatie van de A-tubuli met de algemene toename van de TATS netlengte en vertakking complexiteit ⁹ is. Bovendien werd aangetoond dat de training mag de T-tubulus remodeling in ratten te keren na een hartinfarct ¹⁹ en dat cardiale resynchronisatietherapie kan leiden tot een herinrichting van de T-tubuli te keren bij honden met atriale tachypacing geïnduceerd hartfalen ^20. Samen genomen, zullen studies zowel in de zieke mens en dier VMs alsook mogelijke therapeutische interventies misschien wel profiteren van hoge kwaliteit celisolatie procedures en gedetailleerde kwantitatieve analyse strategieën zoals beschreven in het protocol en de resultaten hieronder secties.

Zoals onlangs aangetoond door mantelvlak versus TATS membraantransport van KATP kanaal isovormen ^21, is het belangrijk om atriale m overwegenyocytes (AMS) als biologisch te onderscheiden, alsmede vergelijkende cardiale cel model versus VM's. T-buisjes werden onlangs gedocumenteerd bij schapen en menselijke AMs ^22. Huidige gegevens wijzen erop dat enkele T-tubuli bestaan ​​in AM cellen en meestal in grotere zoogdieren als schapen en mensen, maar niet in de kleine knaagdieren ^23. In tegenstelling tot VM, in AMs intracellulaire Ca2 ⁺ afgifte blijkt plaats te vinden van het celoppervlak teeltmateriaal door diffusie naar het celcentrum waardoor aangegeven ruimtelijke en temporele Ca2 ⁺ gradiënten ^23. In dit kader lijkt het van belang om de mechanismen van intracellulaire Ca ^{2 +} signalering instabiliteit voor veel voorkomende ziekte vormen verhelderen zoals atriumfibrilleren ^24. Samengevat, zijn zowel AM VM celisolatie en elk voor gezonde en zieke harten algemeen gebruikt protocollen. Alleen als celisolatie goed uitgevoerd zoals beoordeeld door microscopische documentatie voldoende cel kwaliteit, moet AM en VM monsters ca zijnrried voorwaarts voor kwantitatieve TATS analyse. Bijgevolg is de volgende protocol secties sterk afhankelijk zijn van hoge kwaliteit mobiele isolaten van muis of andere soorten, gevolgd door live-cell microscopie intact TATS membranen te analyseren. Zoals reeds eerder op gewezen, karakterisering van TATS membranen is een uitdagend onderzoeksgebied met een neiging tot fixatie en voorbereiding artefacten ^6, membraan veranderingen als gevolg van osmotische veranderingen, en resolutie beperkingen van conventionele lichtmicroscopie ^9. We merken op dat de recente state-of-the-art-protocollen voor de isolatie van de mens AMs voor Ca ^{2 +} imaging en patch-clamp en rat VMs voor celkweek zijn eerder gepubliceerd in dit tijdschrift ^25,26.

Protocol

OPMERKING: Alle dierlijke procedures werden beoordeeld en door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van het Universitair Medisch Centrum Göttingen goedgekeurd in overeenstemming met de humane zorg en het gebruik van proefdieren. 1 Isolatie van atriale en ventriculaire Myocyten van de Muis van het Hart Handvat dieren zo voorzichtig mogelijk en volgens de goedgekeurde protocollen om stress te minimaliseren in het algemeen en in het bijzonder om potentiële krachtige onbedoelde effecten van neuro-hormonale excessen op geïsoleerde cardiale cellen voorkomen. Bovendien injecteren elke muis met heparine (500 IU / kg lichaamsgewicht sc) ten minste 20 min voor hart winning tot bloedstolling en micro emboli die aanzienlijk kunnen compromitteren de opbrengst en integriteit van hartcellen tijdens isolatie te voorkomen. Verdoven muizen 12 weken of ouder door isofluraan inademing jaar, bevestigen afwezigheid van pijn terugtrekking reflexen, en euthanaseren dieren door cervicale dislocatie. Pak het hart snel na eerder vastgestelde deskundige protocollen (bijvoorbeeld, zie Kaestner et al. 26 en Louch et al. 27). Vermijd onbedoelde schade aan de boezems door onnodige knijpen of uit te rekken. Zorgvuldig behouden het weefsel van de proximale aorta ascendens met een paar pincetten stomp en rechte schaar om een ​​doorlopende transversale snijrand via aorta vaatwand, wat belangrijk is voor succesvolle infusen en perfusie van het hart vast. Breng het uitgesneden hart onmiddellijk in ijskoude Ca2 +-vrije nominaal perfusiebuffer (oplossingen zie tabel 1). De grote vaten geklemd tijdens de overdracht via de lucht in de buffer te houden om onbedoelde luchtembolie te voorkomen totdat het hart volledig is ondergedompeld. Gebruik BDM in de buffer en ijsgekoelde oplossing cardiale contractie te remmen. Gebruik een verrekijker zoom microscoop met voldoende 3D Illumnatie. Canule de aorta onder panoramische StereoVision van het hart met een glad, gepolijst oppervlak 21 G canule (buitendiameter 0,81 mm, voor een normale muis hart gewicht) die volledig moeten worden ingevuld met buffer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de canule door een proximale oplossing reservoir (bijvoorbeeld een injectiespuit) verbinden door middel van een 2-weg Luer klep om snelle oplossing flow control. Bevestigen onder verrekijker vergroting dat de canule correct is geplaatst in de aorta, dat is ongeveer 1 mm boven de aortaklep en coronaire takken. Absoluut te vermijden elke passage door of onbedoelde perforatie van de aortaklep met de canule (dit zal permanent aorta klep sluiting verstoren en daardoor verstoren cardiale perfusie). Bind de aorta zachtjes maat omtreksrichting gerichte anti-slip groeven nabij het uiteinde van de canule met twee zijden hechtdraden. Niet spoelen van de coronaire arteries krachtig op elk punt. Sluit de oplossing gevuld canule gebonden aan de aorta en het hart van een goed sluitend uitstroom connector van een op maat gemaakte en vooraf gekalibreerd perfusiesysteem, aka de gewijzigde Langendorff setup (hetzij met behulp van constante druk of constant debiet, zie ook bespreking hieronder). Perfuseren het hart zo spoedig mogelijk 4 min met zuurstof perfusie buffer bij 37 ° C (termijn perfusiesnelheid: 4 ml / min). Start de digestie door het schakelen van de perfusie met collagenase digestie buffer (600 U / ml collagenase type II) gedurende 8-10 minuten bij 37 ° C. Bewaken van de voortgang van het weefsel spijsvertering door te bevestigen soortgelijke veranderingen weefsel waaronder toenemende ondoorzichtigheid, zachtheid en slapheid in het hele zichtbare hart oppervlak. Ontleden de hartkamers indien nodig na digestie. Plaats de gecannuleerd hart onder een binoculair microscoop en visualiseren de achterste hartwand. Ontleden resterende niet-hartweefsel bijvoorbeeld een longnd delen verblijf verontreiniging cel in de digestiebuffer middels micro schaar voorkomen (bijvoorbeeld spring schaar met 8 mm rechte bladen) zoals getoond in figuur 1. Volg een checklist die bijzonder kamers, gebieden en / of cellen van de collagenase digestie hart worden geoogst (figuur 1): linker en / of rechter atrium, vrij linker en / of rechter ventrikel wand, en / of ventriculaire septum. Voor dissectie specifieke hartweefsel, in een relatief breed en vlak dissectie bad bekleed met een enkele mm dikke silicone elastomeer. Bevestig de apex van het hart met een fijne insect stalen pin onderaan elastomeerlaag. Afleiden rechts hartoor en ontleden het rechter atrium boven de atrioventriculaire kleppen. Ga door de dissectie met het linker atrium. Ontleden en de vezelachtige klep apparaat weggooien. Tot slot, ontleden het links en rechts vrij ventriculaire wanden en het septum en / of kleineer weefsel zonodig onderdelen. Opmerking alleen voor stagiairs: naar de praktijk te krijgen, te beginnen met de niet-verteerde muis harten. Voor het gemak van anatomische oriëntatie, oefenen de tissue handling inclusief alle opeenvolgende dissectie stappen onder binoculair zicht, zoals weergegeven in figuur 1. Zodra de 3D ​​anatomie, manueel hanteren onder de binoculair zicht, en dissectie stappen zijn voldoende vertrouwd, ga verder met de collagenase verteerde muis harten als hierboven beschreven. Voor ventriculaire myocyte (VM) celisolatie: breng het ventriculaire weefsel in 2,5 ml vers spijsvertering buffer. Indien gelijktijdige cel isolaties uit verschillende organen, bijv, atria en ventrikels wordt geprobeerd kan een tweede persoon via een been van de cel dissociatie procedure nemen zowel te minimaliseren en een optimaal gebruik van muizen door gecoördineerde hanteren van meerdere hartweefsel. Ga door met stap 1.9.1-1.9.4, daarna 1.10. Ontleden ofwel de gehele ventriculaire weefselof specifieke delen daarvan (bijvoorbeeld LV, RV, vrij wanden en / of septum) in bij benadering 1 mm 3 stuks in 2,5 ml digestiebuffer met scherpe schaar (bijvoorbeeld spring schaar met 8 mm rechte bladen) in een 60 mm petrischaal . Zachtjes distantiëren VMs in celsuspensie door langzame wrijven van het weefsel stukken met een transfer pipet. Vermijd luchtbellen in celsuspensie. Voeg 8 ml stopbuffer de VM celsuspensie en breng de celsuspensie in een 15 ml conische buis. Laat het restmateriaal stukken bezinken op de bodem gedurende ongeveer 15 seconden, maar kort genoeg om geïsoleerde cellen in suspensie blijven. Vervolgens oogsten de VM schorsing via overdracht van het volume supernatant naar een nieuwe buis van 15 ml. Als er te veel weefsel stukken aanwezig zijn, gebruik als alternatief een minimaal 200 urn afstand nylon mesh om het weefsel stukken scheiden van de celsuspensie. Laat de VM celsuspensie naar de bodem van een 15 ml cosche buis door de zwaartekracht gedurende 8 minuten. Wasstap: verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de resterende VM pellet in 10 ml perfusiebuffer. Herhaal wasstap 1.9.5 (optioneel: voeg extra wasbeurt stappen om geleidelijk verhogen van de Ca 2 +-concentratie als nodig). Resuspendeer de vaste VM pellet in 10 ml perfusie buffer en de resterende celsuspensie volume in 1,5 ml microcentrifugebuizen (ongeveer 50.000 VM cellen per buis) te verdelen. Voor atriale myocyte (AM) celisolatie: breng het verteerd / ontleed atriale weefsel in 1 ml vers spijsvertering buffer. Snijd het gedeeltelijk verteerde atriale weefsel in ongeveer 1 mm 3 stuks in 1 ml spijsvertering buffer met behulp van micro schaar in een kleine petrischaal (bv 60 mm diameter). Zachtjes distantiëren AM cellen uit de verteerde weefsel stukjes in celsuspensie met wrijven met een 1 ml plastic pipet met een cut tip om schadelijke fluïdumstralen voorkomen. Tijdensaanwrijven strikt voorkomen dat luchtbellen in celsuspensie. Na mechanisch roeren, voeg 4 ml stop buffer (50 uM CaCl2; 10% BCS) om alle resterende collagenase activiteit in celsuspensie arresteren. Breng de AM celsuspensie in een 15 ml conische buis. Laat het restmateriaal stukken bezinken op de bodem gedurende ongeveer 15 seconden, maar kort genoeg om de geïsoleerde cellen in suspensie blijven. Oogst volume supernatant dat de vrije AM cellen via oplossing overplaatsing naar een 15 ml buis. Centrifugeer de AM celsuspensie, bijvoorbeeld, 2 min bij 20 xg bij kamertemperatuur of – bij voorkeur voor membraan studies – laat de cellen tot rust komen langzaam door de zwaartekracht gedurende 20 minuten in een 15 ml conische buis. Wasstap: de bovenstaande vloeistof en voorzichtig resuspendeer de pellet in AM 5 ml perfusiebuffer. Herhaal 1.10.4. Hersuspenderen AM cellen zachtjes in 5 ml perfusie buffer. Verdeel de celsuspensie volume in 1,5 ml microcentrifuge tubes (ongeveer 1000 AM cellen per buis). Te analyseren en documenteren van de geïsoleerde kwaliteit mobiele populatie voor elk hart, waaronder de celopbrengst behulp trypaanblauw vlekken. Hiervoor verdun 500 ui van de celsuspensie met 1: 1 vol / vol met trypan blauwe oplossing (eindconcentratie 0,02%) met 1 ml Uiterste pipetpunten. Meng de cellen en de trypan blauwe licht door zeer langzaam op / neer pipetteren. Breng onmiddellijk de trypan blauwe celsuspensie met een Neubauer type cytometer verbeterd en tel de intacte myocyten behulp van een omgekeerde microscoop. Uitsluiten alle cellen met zichtbare schade membraan blebs, onderbroken strepen, contracturen en cellen accumuleren intracellulaire trypan blauw (figuur 2). Ook uitsluiten spontaan samentrekkende cellen, die gevoelig zijn voor de daaropvolgende celdood zijn. Om de telling van intacte cellen in suspensie te beoordelen, alleen gebruiken hartspiercellen met regelmatige strepen die hele trypaanblauw sluitenhet celvolume. Oordelen over de integriteit van individuele atriale en ventriculaire myocytes door doorgelaten licht microscopie. Afbeelding opslaan de heldere veld als een TIF-bestand voor de documentatie en verdere analyse. Gebruik de volgende criteria voor de analyse van cardiale celintegriteit: bevestigen de aanwezigheid van regelmatige strepen over het gehele zichtbare cel volume; bevestigen de voortdurende integriteit van het mantelvlak membraan aan beide zijden cel parallel aan de myofilamenten; visualiseren scherpe vertanding bij de ingelaste schijven aan beide zijden cel die de integriteit van de specifieke oppervlakte membraan structuur weer te geven; en visualiseren de fluorescerende signalen van TATS membranen (of immunolabeled caveolin-3-eiwit of een ander membraan markers) zoals beschreven in hoofdstuk 3 voor lokalisatie correlatie naast de onderliggende cel-specifieke helder beeldveld morfologie (bijvoorbeeld, combineer beide beelden met ImageJ als overlay verbinding IMAGe). Bepaal de sarcomeer lengte van de helderveld beelden. Voor gemiddelde sarcomeer lengte, meet de afstand van elkaar uitgelijnd sarcomeer strepen, en verdeel de afstand door het aantal sarcomeren. Meet minstens twee locaties per cel. Voer de analyse uit met commerciële software of offline met ImageJ. OPMERKING: Als behandeld met ontkoppeling agenten, intact ontspannen VM uit muis hart tonen een gemiddelde sarcomeer lengte van ~ 1,9 micrometer 28. Kwantificeren van de morfologie en de afmetingen van de individuele atriale en hartspiercellen van de verzonden afbeelding lichtmicroscopie. Bedenk dat AM en VM cellen aanzienlijk verschillen in grootte. Meet de cel lengte, breedte, en het gebied, en het berekenen van de lengte: breedte verhouding. Analyseer de 2D cel afmetingen van het doorgelaten licht afbeelding in ImageJ met de opdrachten polygoon selectietool en toe te voegen aan ROI manager, analoog aan Figuur 3. Indien morfologische cijzigingen worden verwacht binnen specifieke studie contexten ander document voor alle cellen de specifieke muizenstam, leeftijd, geslacht, hartgrootte en eventuele maatregelen voor daaropvolgende data classificatie. 2 Kleuring van TATS Membranen in Living atriale en ventriculaire Myocyten Laad de beeldvorming kamer (bijvoorbeeld POC-R2) met een 42 mm glas dekglaasje. Voor stabiele myocyten bevestiging aan het dekglaasje bereiden 20 ul van laminine oplossing 1:10 verdunning van de laminine voorraad in fysiologische perfusie buffer (eindconcentratie 0,2 mg / ml). Spreid 20 ul van de laminine oplossing gelijkmatig over de glazen dekglaasje. Bereid 800 pi van een 50 pM di-8-ANEPPS oplossing perfusiebuffer. Hiervoor Verdun 20 ui 2 mM di-8-ANEPPS voorraadoplossing in 780 gl fysiologische buffer. VM's vlekken, laat de cellen af ​​te wikkelen door de zwaartekracht gedurende 8 min in een 1,5 ml reageerbuis. AMS vlek, ofwel gebruik maken van de zwaartekracht sedimentatie of spin de celsuspensie gedurende 2 min (zie 1.10.3). Voor beide amendementen en VM's, verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof, terwijl het vermijden van onnodige onrust van de cel pellet en voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 800 ul van di-8-ANEPPS bevattende oplossing (50 uM). Onmiddellijk over te dragen van de di-8-ANEPPS / myocyt ophanging op de-laminin gecoate dekglaasje in de beeldvorming kamer. Vlekken op de VM suspensie voor 15 min bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder langzaam overtollige volume via de opwaartse vloeistof meniscus aan de zijkanten van de beeldvorming kamer met een manuele pipet. Bevestigen dat de meerderheid van de di-8-ANEPPS gekleurd myocytes stevig blijft verbonden aan de-laminin gecoate dekglaasje en niet worden blootgesteld aan lucht. Vervolgens was de bijgevoegde myocyten suspensie eenmaal door langzaam toevoegen van 1 ml van perfusie buffer gevolgd door het verwijderen van overtollige vloeistof met inbegrip van niet-hechtende cellen. Overlay voorzichtig bevlekt en oppervlak bevestigd myocyten met 1 ml perfusiebuffer langzaam van de kant van thij beeldvorming kamer. Plaats de beeldvorming kamer op de microscoop podium. 3 Beeldvorming van TATS Membraanstructuren in Living atriale en ventriculaire Myocyten In het algemeen, kies zorgvuldig de best mogelijke fluorescentiemicroscoop optie (s) beschikbaar voor TATS membraan beeldvorming. Voor confocale beeldvorming, overweeg recente generatie, moderne fluorescentie microscopen met geoptimaliseerde PMT serie detectoren en foton recycling routes die fluorescerende intensiteit van het signaal te maximaliseren. Voor confocale beeldvorming van kleinere details van TATS membraanstructuren gebruik een objectief 63X 1,4 NA olie of – afhankelijk van de beschikbaarheid – gebruik een STED superresolutie microscoop voor kleinste TATS informatie zoals beoordeeld voor myocyt- specifieke toepassingen door Kohl et al 34 Voor algemene beginselen van het hoog. resolutie fluorescentie microscopie, verwezen naar de paragraaf discussie. Stel de imaging parameters op te sporen de meeste, idealiter alle di-8-ANEPPS gekleurd intracellulaire membranen in een bepaalde myocyte beeldvlak. Gebruik de volgende parameters als uitgangspunt voor confocale laser scanning microscopie: excitatie 458 nm bv bij 3% van de maximale laservermogen; detecteert het uitgezonden signaal tussen 550 nm en 740 nm; detector te krijgen (bijvoorbeeld, meester commando 800); en pinhole 1 AU voor een optische schijfje dikte van 900 nm. Pas deze parameters de signaal-ruis te optimaliseren. Gebruik helderveld mode om een intacte AM of VM cel geval (figuren 4A en 4B) selecteren. Zie punt 1.12 van relevante criteria hoe celintegriteit oordelen aan cellen te selecteren als samengevat: cel-brede regelmatige strepen en gelijke sarcomeer afstand, scherpe oppervlak randen en ribbels aan alle vier zijden cel, continue integriteit van de laterale oppervlak membraan, en de afwezigheid van elk membraan blaasjes. Neem een ​​monster beeld van een centrale intracellulaire myocyte sectie. Aan te passen de ROI gebruik van de "oogst" functie →, Passen het gewas venster → de uiteindelijke pixelgrootte meet 100 nm x 100 nm. Stel de x-as van het gewas venster te corresponderen met de grote (axiaal / lengte-as) van de myocyten. Selecteer de uiteindelijke beeldvlak. Gebruik enkele beeldframes de juiste beeldvlak handmatig in de z-richting. Bevestigen dat de TATS membranen, waaronder T-tubulus en A-tubulus componenten, wel duidelijk zichtbaar in het brandvlak. Merk op dat een typische intracellulaire beeldvlak een kern als intracellulaire referentiepunt omvatten. Zie de voorbeelden in figuren 4A en 4B. Opmerking: In het algemeen houden cel blootstelling aan laserlicht zo kort mogelijk. Indien mogelijk, gebruik maken van enkele foto frames om de optimale focal plane bepalen in hartspiercellen. Stel de pixel verblijftijd ongeveer 0,5 usec. Selecteer 16x middeling en neem het beeld op als momentopname. Herhaal het beeld snapshot stap naar de juiste beeldvlak een vasts geschetste TATS membraanconstructies in 3.5 als nodig. Sla het uiteindelijke beeld en bevestigen dat het bestand in de doelmap werd gered. In het algemeen, slaat u alle beeldbestanden in hetzelfde formaat (bv LSM) voor een uniforme toepassing van analyse software. Voorafgaand aan een beeldanalyse, bevestigen nogmaals voldoende celintegriteit off-line (overwegen vermeld onder stap 1.12.1 criteria) en exclusief eventuele beschadigde cellen uit de analyse. Zie de voorbeelden in figuren 4C en 4D. 4 Analyse van de TATS Membraan netwerk en zijn componenten De volgende beeldverwerking stappen voor een directe analyse van TATS membraan componenten worden samengevat als top-down workflow diagram in de figuren 5A en 5B. Open het beeld van een di-8-ANEPPS gekleurd myocyt in Fiji (http://fiji.sc/), een vrij beschikbare variant van ImageJ die analyse plugins essentieel voor bevatbeeldverwerking. Voor verdere informatie verwijzen wij u naar Schindelin et al 29. Sla de afbeelding op → Bestand → Opslaan als → Tif. Om de TATS membraan componenten analyseren, selecteert u de juiste ROI exclusief de buitenkant membraan signaal, gebruik dan de "polygon selection" tool om de ROI grens met uitzondering van het buitenste oppervlak membraan (sarcolemma) en met inbegrip van de intracellulaire gedeelten van TATS membranen af ​​te bakenen, zoals weergegeven in Figuur 5A (ROI). Voeg de geselecteerde ROI aan de "ROI Manager" door het toepassen van Analyze → Extra → ROI Manager. Om een ​​specifieke ROI voor de oriëntatie analyse van TATS componenten selecteren, plaatst u de belangrijkste longitudinale cel-as en de x-as parallel. Als de cel is licht gebogen, selecteer meerdere ROI's en lijn elke ROI individueel. Sluiten alle kernen van de analyse. Uitsluiten geen overmatig gebogen cellen uit de analyse, omdat nauwkeurige uitlijning van ROis zal steeds moeilijker worden en het verhogen van oriëntatie fouten tijdens de analyse. Verwijder alle ongewenste signaal informatie uit het buitenste oppervlak membraan: Bewerken → Wis Buiten aan de "geselecteerde ROI" (figuur 5A) te genereren. Zorg ervoor dat het geselecteerde ROI bevat alleen de intracellulaire membraan delen, die overeenkomen met de TATS netwerk. Voer de volgende keten van beeldverwerking stappen (commando's) voor de daaropvolgende kwantitatieve analyse zoals beschreven in figuur 5A. Klik op → Proces → Aftrekken Achtergrond. Stel de Rolling bal straal tot 5 pixels. OPMERKING: Stel de rollende bal straal tot 5 pixels als het beeld te analyseren heeft een pixelgrootte van 100 nm x 100 nm. Voor andere pixelgroottes stellen de rollende bal radius het aantal pixels die ongeveer overeenkomt met een fysieke straal van 500 nm. Klik op → Proces → Verbeter Local Contrast (ClahE). Stel de blokgrootte tot 49, het histogram bakken tot 256, de maximale helling naar 3, en het masker op "none". Klik op → Proces → Smooth. Klik op → Plugins → Segmentatie → Statistische Gewest samenvoegen. Stel de parameters voor Q100 → klik op Toon Gemiddelden. Bevestig volledige verwerking van de statistische regio fusie aangaan aangegeven met automatische presentatie van een nieuw image frame en bevestigen dat het label "SRM Q = 100" verschijnt. Ga verder met de volgende stappen met dit beeldbestand. Klik op → Beeld → Type → 8-bit. Klik op → Afbeelding → Aanpassen → Drempel. Kies de drempel laag genoeg om de meeste sporen, idealiter alle TATS structuren, vermijdt in het bijzonder de uitsluiting van TATS componenten met een lage signaal intensiteit (gebruik een drempel van 40 als uitgangspunt). Raadpleeg de "Representatieve resultaten" sectie voor gedetailleerde data-uitgang en de voorbeelden in figuur 6(Bovenste drempel van 255). Documenteer de uiteindelijke keuze van de drempel parameters. Merk op dat de juiste keuze van de drempel alleen specifieke TATS membraanstructuren vals positieve signalen als gevolg van achtergrondgeluiden mag produceren, maar niet. Bevestig correct superpositie van TATS beelddetails versus geëxtraheerd skelet gegevens, met name voor gemiddelde en hoge fluorescentie signaalniveaus, waarbij de (display) continuïteit van de skeletstructuur overeenkomen. Zodra een passende drempel is vastgesteld, gelden dezelfde drempel om alle beelden tijdens de analyse en herhaal de overlay vergelijking van het oorspronkelijke signaal versus skelet gegevens om consequent deze potentiële bron van vertekening te minimaliseren. Klik op → Apply: de beeldgegevens wordt binair zoals weergegeven in figuur 5 onder "Threshold". Klik op → Plugins → Skeleton → schets maken (2D / 3D). Sla het skelet 2D-afbeelding (zoals weergegeven in figuur 5) als TIF-bestand doorop → Bestand → Opslaan als → Tif klikken. Analyseer het skelet beeldbestand voor kwantitatieve data-uitgang door op → Plugins klikken → Analyseer Skeleton (2D / 3D). Kies Prune cyclus methode: geen. Bevestig het automatisch genereren van de resulterende gegevens tabel. Sla de automatisch gegenereerde data tabel als txt-bestand. Selecteer de gewenste kwantitatieve parameters, zoals het aantal vertakkingspunten en de gemiddelde scheutlengtes zoals blijkt uit voorbeeldgegevens in figuur 7. Bestudering van verdere gegevensanalyse met aanvullende / ondersteunende software tools zoals Excel en passend. Overwegen om geautomatiseerde beeldverwerking routines gebruiken waar mogelijk met inbegrip van alle nodige stappen onder 4.5 beschreven aan de analyse tussen de afzonderlijke beelden en / of afbeelding batches te harmoniseren. Gebruik het voorbeeld Aanvullende Code bestand met een beeldverwerking Macro geprogrammeerd voor Fiji (aanpassen van de programmering als nodig). Analyseer de individu oriëntaties van alle of selecteer TATS netwerkcomponenten van het skelet beeldgegevens door de Fiji-plugin "Directionality". Genereer een richtingsgevoeligheid histogram waarbij de respectievelijke axiaal georiënteerde A-buisje of dwars georiënteerd T-tubuli componenten worden vertegenwoordigd door de 0 ° of 90 ° bakken. Let op de juiste referentie van beeldoriëntatie en dat het belangrijk is voor de x-as van het beeld nauw overeen met de belangrijkste (longitudinale) 0 °-as van de VM cel zoals getoond in figuur 8 en Representatieve resultaten. Klik op → Analyseren → Directionality → opgeven Methode: Fourier componenten, Nbins 180, Histogram beginnen -45 → klik op Beeldscherm tafel. Sla de nieuw gegenereerde en weergegeven resultaten tafel inclusief bijbehorende histogram gegevens als txt-bestand. Overweeg een nadere analyse van het txt-bestand gegevens door gratis software tools zoals Excel en als dat nodig is. Om subklassen van het genererengegevens als gegroepeerd datasets bijvoorbeeld voor alle cellen behandeld onder dezelfde voorwaarde (en mogelijk andere voorwaarden), herhaal dan de analyse stappen 4,1-4,7 voor alle relevante afbeeldingen waar nodig. Importeer de skeletonized data parameters van alle beelden in een gecombineerd Excel-bestand met het oog op de gemiddelde waarden af ​​te leiden. Daarnaast importeert alle gerichtheid histogram gegevens uit dezelfde gegroepeerde data tot een gecombineerd Excel-bestand te berekenen en genereren van de gemiddelde gerichtheid histogram. Overweeg verdere verwerking van gegroepeerde datasets om extra TATS netwerk parameters van belang voor individuele of tussen de verschillende behandelgroepen analyseren als dat nodig is.

Representative Results

In addition, to the TATS membrane network analysis a number of commonly used cell biology techniques like intracellular Ca2+ imaging, patch-clamp electrophysiology, or pharmacological dose-response studies depend critically on high quality primary cell isolation from the atria or ventricles or select parts of heart tissue to enable characterization of mature differentiated, structurally and physiological intact cardiac myocytes. Hence, the isolation and quality assessment for AM and VM cells described in section 1 are ultimately useful for many different questions including the here described TATS network analysis, which depends critically on intact membrane and cell integrity. Figure 1 provides a step-wise manual of images how to proceed with the cardiac tissue dissection starting with the atrial chambers in mouse heart. Subsequently, the ventricular chambers and the septum are prepared and dissected as needed. Precise selection and preparation of the correct tissue parts is important to reliably establish AM and VM isolations with sufficient cell purity. Following collagenase digestion it can be relatively difficult to identify the correct line of dissection between atrial and ventricular tissue, yet once AM and VM cells are mixed uncontrolled in cell suspension, it is impossible to reverse the mixed cell population. Therefore, anatomical orientation, 3D tissue visualization, sufficient experience with digested tissue handling, correct identification of specific tissue parts and their dissection lines will all contribute to the success of the cell isolation. Figure 1.Dissection of atrial tissue. (A) Facing the anterior portion of the heart, two surgical sutures fix the proximal aorta to the stump end of a 21 G steel cannula. (B) View towards the heart basis shows remaining lung tissue obstructing the atrial chamber view during dissection. LA, left atrium; RA, right atrium. (C) Remaining lungtissue and great vessels were removed to access the atrial chambers. Filled black triangle, pulmonary artery; striated triangle, pulmonary veins; filled white triangle, upper vena cava; boxed triangle, lower vena cava. (D) First, the right atrial wall is dissected while the forceps hold the atrial appendage. (E) View into the right atrial chamber cavity. The black triangle marks the intact interatrial septum. (F) The dissection is continued to enter the left atrial chamber cavity. (G) Following complete dissection of the left and right atria, the atrioventricular valves become visible. The fibrous valve apparatus is dissected and discarded to subsequently harvest only ventricular muscle tissue. (H) Posterior view of the isolated left and right atria. LA, left atrium; RA, right atrium.Scale bars: 700 µm. To determine the quality of cell isolations, Figure 2 provides typical cell examples during assessment of the yield and viability of typical rod or brick shaped striated intact myocytes, both for AMs and VMs. Little damaged, visually inconspicuous as well as severely damaged cells with abnormal excessively curved morphologies, or abnormal spherical shaped cells, can be readily identified including trypan blue exclusion as described in section 1.11. While intact myocytes remain bright and homogenously striated when exposed to extracellular trypan blue, damaged cells typically show multiple membrane blebs and/or quickly accumulate trypan blue intracellularly indicating membrane damage. However, trypan blue by itself can harm cells through unnecessarily long incubation and immediate cell quality assessment is therefore mandatory. Examples of more obvious forms of cell damage like myofilament contracture or gross surface damage compromising cell integrity are shown in Figures 4Cand4D. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2.Trypan blue exclusion cell staining. Isolated (A)AM and (B)VM cells are mixed in suspension with trypan blue and visualized by an inverted light microscope shown at 40Xmagnification. Note thatabnormal spherical cells in (A)and (B)taking up trypan blue, which indicatesmembrane leakage and structural damage. In contrast, the centralAM and VM cells with intact membranes exclude trypan blue as shown. Furthermore, note that intact AM and VM cells show sarcomere striations throughout their cell volume, nomembrane blebs, and sharp edges at the both lateral sides and both intercalated discs. Scale bars: 20 µm. Following successful isolation, cell yields of VMs from 5 x 105 to 106 can be expected from a single mouse heart digestion. The yield of AMs is significantly lower in the order of 3 x 103to 3 x 104 rod-shaped, trypan blue excluding cells. In contrast to VM, AM isolations occasionally fail even in experienced hands. Step 1.11 summarizes procedures how to estimate the yield of isolated healthy cells in suspension. Additionally, determine the average cell dimensions through step 1.13 as shown in Figure 3 for individual AM or VM cell isolates or to compare AM versus VM cell populations side-by-side (as needed). Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3.Bright field morphometric analysis of cardiac myocytes. The VM contour was detected by the image analysis tools described under step 1.13. Use the polygon selection tool to visually mark and define the cell extracellular border defined by the outer surface membrane for analysis. Ad the selected region of interest (ROI) to the ROI manager followed by 1D distance measurements. For comparative studies of AM vs. VM dimensions, it is useful to document the cell length, width, and area, and to calculate the length:width ratio. To fluorescently stain TATS membranes either in AM or VM cells, the integral membrane dye di-8-ANEPPS is used as described in section 2 followed by confocal microscopy, which resulted in the representative images of TATS networks shown in Figures 4A and 4B. In addition, Figure 4A shows the corresponding transmitted light image of an intact AM side-by-side with the confocal TATS image (for image acquisition see section 3). As described by step 1.12, the morphological and surface membrane integrity of living myocytes is judged through the transmitted light images. The magnified region of the di-8-ANEPPS signal highlights the underlying morphology of the TATS network in AMs, characterized by abundant axial (longitudinal) membrane tubules. In contrast, the TATS morphology of healthy VMs as shown in Figure 4B is characterized by approximately similar numbers of axial and transverse components. In contrast, Figures 4C and 4D show examples of damaged cardiac myocytes that should be excluded from further analysis. In particular, the AM cell in Figure 4C is contracted as evidenced by an abnormally short sarcomere length of 1.2 µm and an irregular, distorted TATS network whereas the VM cell in Figure 4D exhibits multiple membrane blebs (some highlighted by red triangles) indicating membrane disruptions, which may occur at the outer surface membrane but also at the TATS membranes. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4.Live membrane staining of intact atrial and ventricular myocytes. Corresponding transmitted light and confocal images of living di-8-ANEPPS stained intact (A)AM and (B)VM cells. In contrast, a partially contracted and potentially damaged AM with a sarcomere length of 1.2 µm is shown in (C). Contracted myocytes typically show abnormally shortened and distorted TATS structures, therefore excluded from further analysis. Another important indicator for cell membrane defects are membrane blebs (red triangles) as shown in a VM in (D). Membrane blebs represent damaged surface membrane structures and cells with blebs should be excluded from further TATS analysis. Furthermore, the VM shows gross damage apparently missing an entire part of its lower left portion (marked by asterisk). In summary, by comparing transmitted light and confocal images, cells morphology and surface intactness is documented and combined with fluorescent signal information. ‘N’ marks nuclei omitted from the analysis of the TATS membrane stain. Yellow bars indicate magnified ROIs from the same confocal image presented above. Scale bars: 10 µm. Please click here to view a larger version of this figure. Confocal images of TATS membranes with a sufficient signal-to-noise ratio as shown in Figures 4A and 4B are accepted for further quantitative analysis. The TATS membrane analysis is based on skeletonized data derived from the fluorescent rectilinear signal components. Figure 5 shows the workflow diagram of the individual image processing steps which are described in detail by steps 4.3 to 4.5. These steps produce skeletonized images representing rectilinear TATS membrane networks as shown for each isolated VM (Figure 5A) and AM cells (Figure 5B). Figure 5.Workflow for skeletonization of fluorescent TATS images. Image processing steps which lead to a skeletonized image of the TATS network are represented by individual step-by-step image examples both for a di-8-ANEPPS stained VM (A)and AM (B). For individual image processing step, please refer to section 4. Note differences in scale bars: 20µm (A) and 10µm (B). Please click here to view a larger version of this figure. A critical step during image processing, determine the appropriate threshold for data binarization as described in section 4.5.6. The resulting binary image should include only true membrane signals from the TATS network but not false structures derived by erroneous thresholding from the background signal noise. Yet, it is important that the threshold is low enough to detect all true TATS structures such that true TATS components are not erroneously lost during image analysis. Figure 6 illustrates the process how to select the threshold during data binarization. While a threshold of 40 as shown in Figures 6B and 6C seems appropriate to detect all true TATS structures individually, choosing a higher threshold e.g., of 60 as shown in Figure 6A does not detect fainter axial membrane structures (ATs) as indicated by yellow triangles. In contrast, choosing a lower threshold e.g., of 20 as shown in Figure 6D leads to erroneous detection of background noise as false-positive TATS structures as indicated by yellow triangles. Figure 6.How to determine the signal threshold during skeletonizing of TATS image data. The examples show TATS skeletons each generated for different thresholds during data binarization (described in step 4.5). Upper images: show the threshold adjustments using Fiji. Lower images: overlay of skeletonized images with the corresponding input fluorescence image and magnified regions as indicated. A high threshold e.g., 60 applied in (A)is apparently not appropriate to detect all true TATS structures as indicated by yellow triangles in the magnified section. A threshold of 40 applied in (B)and (C)detects all TATS structures and correctly does not detect background noise, whereas a low threshold e.g., 20 in (D)erroneously identifies background noise as TATS structures and thereby produces false-positive signals of non-existing membrane structures. False-positive signals are indicated by yellow triangles in the magnified inset. Please click here to view a larger version of this figure. The “Analyze Skeleton (2D/3D)” plugin supports the detailed analysis of skeletonized TATS structures. Once executed, the plugin produces a data table with the following skeleton parameters: #branches, #junctions, #end-point voxels, average branch length, #triple points, #quadruple points, and maximum branch length. For a detailed description of all possible output parameters please refer tohttp://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton and related articles29-31. A typical data table output is shown in Figure 7A. The parameters can be further used to derive the total skeleton length per area or the number of junctions per area. Exemplary calculation of the number of branches multiplied by the average branch length gives the total length of the continuous skeleton in 2D: Total skeleton length per ROI: ∑ (#branches x average branch length)= 5155 px = 515.5 µm The total length of the skeleton can be normalized to the image area. For the example shown in Figure 7 the normalized skeleton length of 0.64µm/µm2 and the sum of all junctions are calculated as shown below: Normalized skeleton length: 515.5 µm / 803.6 µm2= 0.64 µm/µm2 Normalized number of junctions: 155 junctions / 803.6 µm2= 0.19 junctions/µm2 Figure 7.Automated data output from skeletonized images. (A) A typical data spreadsheet generated by the 'Analyze Skeleton (2D/3D)' plugin from the skeletonized image shown in (B). For a detailed description of possible output parameters please refer to http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton. Please click here to view a larger version of this figure. The image processing steps described under 4.5 and illustrated in Figure 5 can be automated using a Fiji macro provided as Supplementary Code File. The commands define repeats of image processing through reiterative steps. The macro can be applied to complete stacks of input images produced through steps 4.3 and 4.4. The macro can be advantageous for the analysis of complete dataset groups, for instance by preparing individual input image stacks for each independent treatment group for automated analysis using the macro commands. The outlined software strategy further enables the TATS network orientation analysis for all components. For this, use the “Directionality” plugin (http://fiji.sc/Directionality)29,31 which produces histogram data showing the orientation distribution of all TATS component orientations. If the x-axis of the input image corresponds to the main axis of a given AM or VM cell, the axial (longitudinal) TATS components will be represented by the 0° bin, whereas the transversal components will be represented by the 90° bin. Figure 8 shows exemplary directionality histograms from skeletonized TATS images for a VM (8A) versus an AM (8B) cell. While the directionality histogram of a typical VM shows a double peak distribution at 0° and 90°, the AM histogram shows a single dominant peak at 0°. These examples are in agreement with earlier observations that individual TATS components of VMs are nearly equally distributed between T-tubules and A-tubules, whereas the TATS components in AMs may be predominantly composed of A-tubules. Figure 8.Representative directionality histogram from TATS networks of individual cells. Directionality histograms were generated from skeletonized images of individual VM (A)versus AM (B)TATS networks. Given that the x-axis of the analyzed image corresponds to the main (longitudinal) axis of the myocyte as shown, A-tubule components are represented by the 0° bin, whereas T-tubule components are represented by the 90° bin. Gauss fits only to the major histogram peakasshown as background graph. Please click here to view a larger version of this figure. Perfusion buffer mM NaCl 120.4 KCl 14.7 KH2PO4 0.6 Na2HPO4 0.6 MgSO4 1.2 HEPES 10 NaHCO3 4.6 Taurine 30 2,3-Butanedione-monoxime 10 Glucose 5.5 pH 7.4 Digestion buffer mM (if not specified) NaCl 120.4 KCl 14.7 KH2PO4 0.6 Na2HPO4 0.6 MgSO4 1.2 HEPES 10 NaHCO3 4.6 Taurine 30 2,3-Butanedione-monoxime 10 Glucose 5.5 Collagenase type II 600 U/ml pH 7.4 Stop buffer mM (if not specified) NaCl 120.4 KCl 14.7 KH2PO4 0.6 Na2HPO4 0.6 MgSO4 1.2 HEPES 10 NaHCO3 4.6 Taurine 30 2,3-Butanedione-monoxime 10 Glucose 5.5 CaCl2 0.0125 bovine calf serum 10% pH 7.4 Table 1.Buffer solutions. The content of three different physiological buffer solutions for cell isolation and imaging are summarized.

Discussion

Although cardiac myocytes have been isolated and studied for decades³², a recent review concluded that consistent high-quality myocyte cell isolations remain challenging²⁷. This reflects relatively complex protocols for isolation of primary cardiac myocytes vis-à-vis a lack of common standard approaches, shared metadata, and transparent cell quality documentation. Cell isolation protocols are usually customized by individual groups, produce variable outcomes of cell isolates, depend on individual model settings (e.g., species, age, coexisting heart conditions), and are usually adjusted for particular experimental conditions. Within the context of the quantitative TATS membrane studies and protocols presented here, an essential level of quality assessment and documentation concerns the confocal or superresolution microscopy of individual cell membrane structures prone to metabolic and isolation protocol dependent changes, both in AM or VM. Importantly, even if high yields of cell isolates suggest healthy intact myocytes, investigators need to document and critically judge each individual cell carefully against morphological criteria of surface and TATS membrane integrity versus non-specific damage due to isolation procedures versus specific changes due to different types of interventions as compared to control conditions. An important variable during cardiac cell isolation is the specific activity of a given collagenase lot. To select a new lot of collagenase, the enzymatic activity of several collagenase samples should be tested against each other by evaluating cardiac myocyte yield and quality, and according to manufacturer instructions. Ideally, a new lot of collagenase is identified with collagenase activity similar to previous successfully used lots (for extended evaluation of possible enzyme activities refer to the “collagenase lot selection tool” in the materials and methods table). Taken together, quantitative approaches of TATS membrane visualization depend critically on cell isolation quality and, vice versa, cardiac cell isolations leading to unspecific membrane damage as documented by TATS microscopy should trigger critical review and correction of the isolation procedures. Since cell isolation quality and TATS membrane visualization and quantification are intrinsically linked, the protocols discussed in this article cover all major aspects as a continuous strategy.

An additional challenge and common issue of cardiac studies, cell damage and/or cell loss occur due to metabolically compromising interventions e.g., following myocardial infarction⁹, yet need to be judged against potential inadvertent damage e.g., following unnoticed air embolism during cell isolation. Isolation of cardiac myocytes from diseased hearts may lead to additional, significant cell loss and decreased cell yields. Therefore, comparison of the total number of isolated intact cells between control and diseased hearts can be meaningful if cell isolation and counting are consistently applied through standardized protocols. Consequently, it is critical to judge cell integrity through an appropriate control group, which reflects the best possible myocyte cell isolation quality. Importantly, individual cell quality and live cell microscopy of healthy versus diseased versus myocytes inadvertently damaged by the isolation procedure may significantly influence the analysis of TATS membrane networks. The protocols presented here therefore emphasize the integrity and stability of physiological membrane components during cell isolation and live cell microscopy of intact membranes. The entire workflow is designed as a continuous strategy to achieve and preserve intact TATS membrane components while excluding damaged cells, since these will exhibit isolation dependent membrane artifacts like disrupted membrane tubules, membrane blebs, and altered TATS networks erroneously under control conditions and compromise further quantitative analysis. Vice versa, the same strategies are crucial for intervention studies with the potential to disrupt TATS membranes, which depend critically on meaningful comparison controls between true healthy versus true diseased cell with TATS membrane changes.

In addition, we address procedures to achieve the technically much more challenging isolation of AM cells. Despite progress and improved protocols, it is important to emphasize that it is not trivial to reproduce high quality cell isolations of VMs and even less reliable for AMs. This is due to the overall lower yield of AM cells where even small errors or variations during cell isolation may lead to complete failure of AM cell isolation, whereas a mild degree of VM cell damage might be less apparent in cell suspension due to relatively high cell numbers compared to AM. Since AM cells might become curved after isolation, analysis through several ROIs can be advantageous as outlined under step 4.3. Following a detailed procedure of cell isolation steps, we provide a protocol for direct integral membrane staining and confocal or STED superresolution imaging of TATS networks both for VMs and AMs. These protocols enable both quantitative analysis and differentiation of select components of TATS membranes through previously established parameters. As compared to VMs, the 3D organization and functional behaviors of the atrial TATS network in AMs are currently less understood.

The procedures to image TATS membranes in living cells (steps 3.1 to 3.7) were developed with commercial confocal (Table of Materials/Equipment) and custom-made STED fluorescence microscopes⁹. To optimize the microscope settings for fluorescent image generation and quantitative TATS analysis, the following points are of general importance:

• Objective
  In order to resolve small details of TATS membrane structures, empirically test which objective provides the highest image quality while focusing several micrometer deep in the cell. Certain confocal microscopes may perform better with water or glycerol objectives, in contrast to the 63X 1.4 NA oil objective used here. Objectives with 100X magnification are used for superresolution STED microscopy, trading off a smaller field of view for nanometric resolution³⁴.
• Excitation and Gain
  The optimal settings of the excitation power and detector gain depend on the microscope light path, laser performance, and sample properties. Ideally, laser power and gain are adjusted to exploit the full range of the detector, yet avoid image saturation. Commercial microscopy software packages usually provide lookup tables that visualize the lower and upper limit of the dynamic range. Furthermore, to minimize dye bleaching employ the lowest possible laser power that still provides sufficient structural TATS membrane details. Also, excitation power should be low enough to avoid cumulative photo damage leading to myocyte contractures and death.
• Pixel Size
  Use a pixel size compatible with Nyquist sampling, approximately half the resolution achieved with the given settings. For confocal imaging a pixel size of 100 nm x 100 nm is compatible, which will also limit bleaching. For superresolution microscopy significantly smaller pixel sizes are used e.g., 20 nm x 20 nm for STED microscopy⁹.
• Dwell Time
  Confocal microscopes provide an averaging function. In general, use the shortest possible pixel dwell time to avoid bleaching in combination with signal averaging e.g., line-averaging ≥ 8 to improve the signal-to-noise-ratio.
• Document the Applied Microscopy Settings Through Meta-data
  Once the settings how to image details of TATS membrane structures were optimized on a particular confocal microscope, safe and/or document the settings (protocol meta-data). Acquire all images within a (or between) group(s) of cells with the same objective, excitation power, gain, pixel size, pixel dwell time, and averaging function. Equal imaging conditions allow for direct comparison and quantitation within a (or between) group(s) of cells.
• For general guidance and further details about principles and applications of confocal microscopy refer to the Handbook of Biological Confocal Microscopy (Pawley J.B., 3^rd Edition, 2006, Springer Science+Business Media, LLC).

In contrast to the direct analysis strategies presented here, previous publications describing TATS membranes and disease related changes, have used regional aggregate readouts of T-tubule density as quantitative strategy^16,17, or indirect regional strategies based on Fourier transformation analysis of striated membrane signals in order to assess T-tubule component regularity⁷. In contrast, the quantitative approaches described here are directly related to individual TATS components and provide a number of additional parameters including membrane network properties and specific components like the percentage of A-tubules. Furthermore, the TATS network density can be quantified as the normalized length of the entire extracted skeleton per ROI area. The number of triple junctions of three individual, continuously connected tubule components can be used as a measure of the branching complexity of the TATS membrane network. We note that any analysis of smallest TATS components depends on the staining procedures. In our experience, 800 µl of a 50 µM di-8-ANEPPS solution are sufficient to stain complete TATS networks in a cell pellet containing 50,000 VM cells⁹. However, if the cell pellet contains a lower number of cardiac myocytes, if powerful fluorescence detectors are available, and if confocal imaging of the overall TATS network distribution rather than smallest membrane details and quantitative changes are of interest, lower dye concentrations may be used based on empirical testing. Finally, a software macro written for the described analysis can be used to automate the image processing steps to facilitate analysis of larger datasets, which is particularly useful for comparison between different treatment groups (e.g., drugs), cell types (e.g., AM versus VM), and pathophysiological interventions (e.g., sham versus myocardial infarction).

For image analysis of TATS networks, the following sequence of principle steps is applied: 1) rolling ball background–subtraction (4.5.1) to remove spatial variations in background intensity; 2) local contrast enhancement (4.5.2.); 3) image smoothing (4.5.3); 4) statistical region merging (4.5.4); 5) defining the threshold of image binarization (4.5.6); and 6) calculation of the skeleton data (4.5.8). A critical step during the skeletonization of fluorescent TATS images is the image binarization shown in Figure 6. The associated thresholding steps ultimately define which true membrane structures are detected to represent the underlying TATS components versus potentially false structures identified by error from background noise. Identification of the correct threshold for binary image analysis should correspond with the true TATS membrane structures, which depends on a sufficiently high signal-to-noise (SNR) ratio each for confocal and superresolution microscopy approaches. Therefore, a sufficient image quality should be established first and subsequently combined with critical judgment of individual cell quality including documentation by bright field images as outlined. Alternative options to adapt the image segmentation protocol for a given microscope data output and/or physiological questions include image deconvolution and other thresholding procedures like “Otsu” or “Iso-data” available as ImageJ plugins. Regardless of the final segmentation procedure, we consider the comparison between extracted and raw data by image overlay a mandatory quality control step. In summary, morphological and membrane integrity of individual isolated myocytes, sufficient staining of intracellular TATS membranes, parameter optimization for fluorescence imaging, and overlay control of extracted skeleton data will all contribute to the quality of fluorescent TATS images and quantitative results.

If larger species than mouse are used for cell isolation, the protocols can be readily adapted as appropriate. For the next larger species, rat hearts can be cannulated with a blunt 14 G cannula (outer diameter 2.1 mm) and perfused at 8 ml/min. Significantly older or diseased hearts may require even larger cannula sizes. In general, cardiac perfusion may be conducted either by constant pressure e.g., using a 1 m high water column between reservoir and aorta or by constant flow using a peristaltic pump. For cell isolation from small rodent hearts like mice and rats constant flow may be advantageous since collagenase digestion will eventually disrupt coronary resistance vessels leading to excessive perfusion rates from leaking vessel beds which will be controlled to some degree by constant flow protocols. In contrast, constant pressure perfusion is advantageous if monitoring of the flow rate and correct cannulation are a priority, which is advantageous for intervention models with altered blood vessel resistance behaviors as well as for training of the cell isolation procedures.

As outlined above, sufficient cell quality is very important for quantitative studies of endogenous membrane systems. However, during heart perfusion and collagenase digestion numerous factors can critically affect the quality of the cell isolation, which should never be underestimated during protocol optimization or trouble shooting²⁷. In particular, the activity of a given collagenase lot should be determined for the specific tissue of interest e.g., atria or ventricles prior to execution of the experimental bona fide studies to establish isolation conditions to be maintained throughout the remainder of the study. Furthermore, the water quality, pH, temperature, optimization and cleaning of the perfusion setup will minimize the risk of inadvertent damage from contaminants and emboli, and potentially additional factors have to be monitored to establish optimal homeostatic conditions during cell isolation. BDM (2,3-butanedione-monoxime) a reversible inhibitor of myosin ATPase cross-bridges is commonly used during tissue dissection and digestion to sustain cardiac muscle relaxation, which increases the yield of cell isolations. Nevertheless, investigators need to be aware that BDM may exert non-specific phosphatase activities leading to off-target effects e.g., inhibition of Na⁺/Ca²⁺ exchange currents under certain conditions³³. For some experiments it might be advantageous to replace BDM by blebbistatin as cardioplegic solution, an inhibitor with a high affinity for myosin at micromolar concentrations which is, however, toxic and relatively expensive and may have other off-target effects. Resting healthy cardiomyocytes should not show any contractions in the absence of electrical stimulation and such cells should be excluded from further analysis. On the other hand, cardiac myocyte contraction and relaxation in response to electrical stimulation at physiological extracellular Ca²⁺ concentrations can be used to establish normal contractile behavior as an additional measure to assess functional cell quality and/or abnormal behavior in heart disease versus healthy control cells.

In summary, the protocols for single cell isolation and quantitative image analysis described here have been successfully applied for confocal and superresolution microscopy of the TATS membrane network in VM⁹ and AM cells²¹ as well as for quantitative analysis of microtubule networks in fixed cardiac myocytes (data not shown). These and future applications of the protocols may open avenues for a variety of experimental questions such as the characterization of TATS membranes at different developmental stages or the analysis of membrane associated protein or organelle structures that contact the TATS network to exert highly localized, domain specific signaling functions in AM and VM cells.

Materials

Chemicals and enzymes
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	B0753
Bovine calf serum	Thermo Scientific, Schwerte, Germany	SH30073	Triple 0.1 µm sterile filtered.
CaCl2	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	21115	Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.
Collagenase type II	Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany	on request	Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II  and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.
Glucose	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	HN06.1
Heparin	Rotexmedica, Trittau, Germany	PZN-03862340	Diluted in 0,9 % NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	9105.4
Forene 100% (V/V)	Abbott, Libertyville, IL, USA	B506	Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	6781.3
KH2PO4	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	3904.2
Laminin (2 mg/ml)	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	354232	Lamination is described under step 2.1.
MgCl2 · 6 H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2189.2
MgSO4 · 7 H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	8283.2
Na2HPO4 · 2 H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4984.2
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	HN01.1
Taurin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS	Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany	D-3167	Stock solution 2 mM in DMSO
Trypan blue	Sigma-Aldrich, Munich, Germany	T8154	Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.
Langendorff perfusion setup
Circulation thermostat	Lauda, Lauda-Königshofen, Germany		Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use.
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump	VWR, Darmstadt, Germany	224-2252	Tubing needs to be changed regularly.
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat	VWR, Darmstadt, Germany	228-4340
Heating coil surroundung perfusion tubing	Rettberg, Göttingen, Germany	custom-made	Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly  in 10 mM NaOH overnight.
Peristaltic pump	Ismatec, Wertheim, Germany	ISM830
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm	Braun, Melsungen, Switzerland	16500C
Three way stop cock Discofix 3SC	Braun, Melsungen, Switzerland	4095146
Instruments
42 mm glass coverslips	Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany	on request	0.13 – 0.16 mm thickness
Cannula 21G	Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA	304432	Cut to a length of ~ 5 mm, roughened with sandpaper.
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm	Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany	on request	0.38 – 0.42 mm thickness
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11151-10
LSM 710 NLO	Carl Zeiss, Jena, Germany		63x 1.4 NA oil objective
Neubauer improved cytometer	Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany	1100000	Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10 – 20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dlutions and counting shortcuts.
POC-R2 Imaging Chamber	Pecon, Erbach, Germany		Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~ 1000 AM and ~ 10,000 VM
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15025-10
Student dumont #7 forceps, inox	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91197-00
Student iris scissors, curved, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91461-11
Student iris scissors, straight, 11.5 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91460-11
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	91402-12
Tissue forceps, 1×2 teeth, slim, 10 cm	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11023-10