मल्टीमॉडल ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तरीके कैरेबियन रीफ भवन मूंगों में नाकड़ा ऊतक आकृति विज्ञान और संरचना प्रकट
Summary
इमेजिंग तकनीक का एक एकीकृत सुइट कैरेबियन कोरल Montastraea annularis और एम में नाकड़ा आकृति विज्ञान और ऊतक संरचना का निर्धारण करने के लिए लागू किया गया है faveolata. प्रतिदीप्ति, धारावाहिक ब्लॉक चेहरा, और दो photon लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग lobate संरचना, नाकड़ा दीवारों, और अनुमान chromatophore और zooxanthellae घनत्व और वितरण की पहचान की है.
Abstract
इमेजिंग तकनीक का एक एकीकृत सुइट कैरेबियन चट्टान निर्माण कोरल Montastraea annularis और एम जिसमें तीन आयामी (3 डी) आकारिकी और नाकड़ा ऊतकों के सेलुलर संरचना का निर्धारण करने के लिए लागू किया गया है faveolata. इन तरीकों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (एफएम), धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग (SBFI), और दो photon लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग (TPLSM) शामिल हैं. SBFI शारीरिक सेक्शनिंग के बाद गहरी ऊतक इमेजिंग प्रदान करता है; यह अधिक से अधिक 2 मिमी के ऊतक गहराई में ऊतक सतह बनावट और 3 डी दृश्य का विवरण. ऊतक सेलुलर संरचना के पूरक एफएम और TPLSM उपज अति उच्च संकल्प छवियों. परिणाम है: (1) बाहरी व्यक्ति प्रवाल जंतु की दीवार और पर पहले से unreported lobate ऊतक morphologies पहचान (2) chromatophores और शैवाल की तरह dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts की 3 डी वितरण और ऊतक घनत्व के पहले सतह नक्शे बनाया. स्पेक्ट्रल अवशोषण मटर500 एनएम और 675 एनएम का KS, क्रमशः, सुझाव है कि एम annularis और एम faveolata क्लोरोफिल और chromatophores के समान प्रकार के होते हैं. हालांकि, एम annularis और एम ऊतक घनत्व और इन महत्वपूर्ण सेलुलर घटकों के 3 डी वितरण में काफी अंतर दिखा रहे faveolata. इमेजिंग तरीकों पर ध्यान केंद्रित इस अध्ययन SBFI decalcified मूंगा ऊतकों की बड़ी मिमी पैमाने पर नमूनों के विश्लेषण के लिए बेहद उपयोगी है कि इंगित करता है. मानार्थ एफएम और TPLSM nondecalcified मूंगा ऊतकों के नमूनों में सेलुलर वितरण और घनत्व में सूक्ष्म submillimeter पैमाने पर परिवर्तन प्रकट करते हैं. TPLSM तकनीक देता है: (1) न्यूनतम इनवेसिव नमूना तैयार करने, (2) बेहतर ऑप्टिकल सेक्शनिंग क्षमता, और (3) न्यूनतम प्रकाश अवशोषण और बिखरने, अभी भी गहरी ऊतक इमेजिंग की अनुमति देता है.
Introduction
ग्लोबल वार्मिंग और साथ पर्यावरण परिवर्तन सीधे उष्णकटिबंधीय समुद्री कोरल 1-4 स्वास्थ्य और वितरण को प्रभावित कर रहे हैं. एकाधिक प्रभावों कोरल विरंजन और संक्रामक रोगों 5-6 के उद्भव सहित मनाया जा रहा है. हालांकि, इन पर्यावरणीय खतरों के भविष्य मूंगा प्रतिक्रिया की अधिक सटीक भविष्यवाणी एक ऊतकीय "आधारभूत" "जाहिरा तौर पर स्वस्थ" कोरल के लिए ऊतक आकारिकी और सेल संरचना और वितरण को परिभाषित करता है, जो स्थापित किया है कि आवश्यकता होगी. बदले में, कोरल तो मात्रात्मक तुलना की जा सकती "प्रभावित". "स्वस्थ प्रतिक्रिया" भी पर्यावरण ढ़ाल भर लगाया जा सकता है कि इतने इसके अलावा, इस आधार रेखा, पर्यावरण की स्थिति की एक किस्म के तहत जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल के लिए स्थापित किया जाना चाहिए. इस आधारभूत स्थापित करने की ओर एक प्रारंभिक कदम के रूप में, एक उच्च संकल्प 3 डी अध्ययन कैसे जाहिरा तौर पर स्वस्थ मूंगा नाकड़ा ऊतक का कार्य शुरू कर दिया गया हैआकृति विज्ञान और सेलुलर संरचना सूर्य के प्रकाश विकिरण में पानी की गहराई में वृद्धि (DD) और साथ घटने का जवाब. परिणाम तो मूंगा अनुकूलन के एक अधिक व्यापक यंत्रवत समझने की स्थापना के लिए, साथ ही प्रवाल-symbiont विकास में अंतर्दृष्टि और प्रकाश कटाई की वृद्धि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
पथरीले कोरल (Scleractinia) सामूहिक मूंगा 7-10 holobiont के रूप में निर्दिष्ट अन्य सूक्ष्मजीवों की एक जटिल संयोजन, के लिए मेजबान खेलने कि औपनिवेशिक मरीन पशुओं invertebrate हैं. वर्तमान अध्ययन में किए गए शोध में एक साथ ऊतक पिगमेंट में बढ़ रही पानी की गहराई और जाहिरा तौर पर स्वस्थ मेजबान मूंगों की सहजीवी zooxanthellae साथ परिवर्तन ट्रैक करने के लिए अत्याधुनिक इमेजिंग तकनीकों के एक कमरे का उपयोग करना चाहता है. इस मूंगा hea के संकेतक के रूप में जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल और अभिनय के लिए एक bathymetric ढाल भर में आवश्यक तुलनात्मक ऊतक सेल "आधारभूत" स्थापित करेगाLTH 10. कोरल पिगमेंट, कहा जाता chromatophores, अवशोषित प्रतिबिंबित, बिखराव, अपवर्तित, टुकड़े करना, या अन्यथा घटना सौर विकिरण 11 के साथ हस्तक्षेप करने के लिए काम करते हैं. zooxanthellae-chromatophore एंडोसिम्बायोटक संबंध मूंगा पशु 12 के लिए रणनीतिक रूप से लाभप्रद प्रकाश कटाई अनुकूलन और कंकाल विकास रणनीतियों के coevolution, साथ ही पौष्टिकता प्लास्टिसिटी (स्थानांतरण खिला रणनीतियों autotrophy heterotrophy करने से पीछे और आगे) सक्षम है.
कुराकाओ के दक्षिणी कैरेबियन द्वीप राष्ट्र (नीदरलैंड एंटिल्स के पूर्व भाग) अरूबा ला Blanquilla द्वीपसमूह (चित्रा 1 ए) trending पूरब पश्चिम के भीतर लगभग 65 किमी उत्तर में वेनेजुएला की है. कुराकाओ से 70 किमी लंबी दक्षिणी तट एक आधुनिक सतत और मिओसिन-प्लिओसीन-प्लीस्टोसीन-होलोसने प्राचीन किनारे की तरफ कोरल रीफ पथ 13,14 शामिल हैं. कुराकाओ लगभग 3 डिग्री सेल्सियस एक भिन्न होता है पर वार्षिक एसएसटी मीनnually, 27.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस के एक औसत वार्षिक तापमान के साथ, सितंबर के शुरू में 29 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम करने के लिए देर से जनवरी में 26 डिग्री सेल्सियस की एक न्यूनतम से लेकर (NOAA एसएसटी डाटा 2000-2010, सेट). यह पहले से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है क्योंकि कुराकाओ (चित्रा 1 ए) के उत्तर पश्चिमी सिरे के पास पड़ी प्लाया कल्कि पर कोरल रीफ (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" डब्ल्यू),, नमूना लेने के लिए चुना गया था इस स्थान पर समुद्री पारिस्थितिकी तंत्र ताजा nonpolluted समुद्री जल 7,15-19 में नहाया है. . दो निकट से संबंधित scleractinian कोरल प्रजातियों, एम annularis और एम faveolata, इस अध्ययन में प्रयोग और विश्लेषण के लिए चुने गए प्रत्येक प्रजाति क्योंकि: (1) शेल्फ को तोड़ने और सम्मान के साथ चट्टान पथ पर प्रदर्शन अलग अलग और nonoverlapping bathymetric वितरण जुड़े कार्बोनेट तलछटी depositional वातावरण (एम annularis रेंज = 0-10 मीटर WD; एम faveolataरेंज = 10-20 मीटर WD 20; आंकड़े 1 बी, 2 ए, और 2 बी); (2) कैरेबियन सागर 21 भर में एक आम कोरल रीफ ढांचे बिल्डर है; और (3) अच्छी तरह से अध्ययन पारिस्थितिक, शारीरिक, और विकासवादी रिश्तों 22 है.
वर्तमान अध्ययन के लिए फील्ड नमूने अपतटीय कुराकाओ पर प्लाया कल्कि के मानक स्कूबा डाइविंग तकनीक का उपयोग किया गया था. एक उथले करने वाली गहरे पानी bathymetric आड़ा काट शेल्फ तोड़ने पर, शेल्फ भर में भाग गया है कि स्थापित है, और गहरे पानी सामने चट्टान के वातावरण में किया गया था. (1) तीन व्यक्ति एम के ~ 1 मीटर व्यास मूंगा प्रमुखों: जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोरल सिर तो सहित इस bathymetric आड़ा काट साथ नमूना लेने के लिए पहचान की गई 5 मीटर पानी की गहराई (MD) में थे, जो सभी के annularis,; एम के और (2) तीन व्यक्ति ~ 1 मीटर व्यास मूंगा सिर faveolata, जो सभी के लिए 12 मीटर WD पर थे. Photosynthetically सक्रिय विकिरण (बराबर) 33-36% पी के रूप में मापा गया था5 मीटर WD पर ए.आर. और 10 मीटर WD में 18-22% बराबर. एसएसटी 5 मीटर और 12 मीटर दोनों की पानी की गहराई में 26 डिग्री सेल्सियस था जब सैम्पलिंग जनवरी में आयोजित किया गया. इन छह मूंगा प्रमुखों की प्रत्येक (, यानी. छह अर्धगोल मूंगा प्रमुखों में से प्रत्येक पर लगभग 45 डिग्री उत्तर अक्षांश) समकक्ष स्थानिक पदों पर तीन प्रतियों में नमूना था. प्रत्येक व्यक्ति नमूना एक साफ कट्टर पंच के साथ एकत्र किया गया था कि एक 2.5 सेमी व्यास मूंगा ऊतक कंकाल कोर बायोप्सी शामिल थे. तीन मूंगा ऊतक कंकाल बायोप्सी मूंगा प्रमुखों में से प्रत्येक से दस्ताने हाथ के साथ मानक वृक्ष पर जांचा गया (एम से 9 5 मीटर WD पर कालोनियों annularis और एम से 9 से 12 मीटर WD पर faveolata). तुरंत गहराई में संग्रह करने पर, प्रत्येक बायोप्सी कोर नमूना एक बाँझ 50 मिलीलीटर polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखा गया था, पेंच शीर्ष सील, और सतह पर लौट आए. समुद्र के पानी से प्रत्येक अपकेंद्रित्र ट्यूब से decanted किया गया था और प्रत्येक कोर बायोप्सी तो, डूबे संग्रहीत, और 4% paraformaldehyde में ले जाया गया था.
<p class="Jove_content"> SBFI इमेजिंग पहले से पूरे मस्तिष्क और पूरे दिल मानव ऊतकों बरकरार माउस भ्रूण, ज़ेबरा मछली भ्रूण, और बरकरार हड्डियों 23-30 के साथ पशु नमूनों की कई प्रकार सहित जैविक नमूने, की एक विस्तृत श्रृंखला पर प्रदर्शन किया गया है. प्रतिदीप्ति या उज्ज्वल क्षेत्र तकनीकों के साथ या तो ऑप्टिकल / प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग इन अध्ययनों के अधिकांश. हालांकि, अध्ययन पिछले 31 में स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन धारावाहिक ब्लॉक चेहरा इमेजिंग का उपयोग अति उच्च आवर्धन पर आयोजित किया गया है. वर्तमान अध्ययन में, एक संशोधित SBFI प्रोटोकॉल के लिए विकसित किया गया है और पहली बार के लिए कोरल के लिए आवेदन किया. एम क्योंकि annularis और एम faveolata प्रवाल जंतु मोटाई में 1-2 मिमी, दिनचर्या प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक से कोई मूंगा नाकड़ा ऊतकों की पूरी मोटाई मर्मज्ञ करने में सक्षम हो जाएगा. इसलिए, हम विशेष रूप से प्रवाल के नमूने के लिए बनाया गया SBFI नमूना तैयार प्रोटोकॉल है. इसके अलावा, हम कस्टम एक stereomicroscope धारक तैयार की है, एक्स और वाई दिशाओं दोनों में स्थानांतरित करने के लिए मोटर चालित है. इस तंत्र बल्कि खुर्दबीन के सामने एक नियमित सूक्ष्म उपयोग कर वर्गों का संग्रह से नमूने के ब्लॉक चेहरे की छवियों लेता है. हम भी मूंगा ऊतकों की पूरी मोटाई भर में छवि को एक ही प्रवाल जंतु एक और nonlinear ऑप्टिकल दो photon सूक्ष्म तकनीक की शुरुआत की. इस विकैल्सीकरण की शर्तें और नमूना तैयार (निर्जलीकरण) और प्रसंस्करण प्रोटोकॉल द्वारा प्रेरित किया जा सकता है कि ऊतक आकारिकी और मात्रा (सिकुड़) में परिवर्तन की संभावना में SBFI द्वारा लगाया सीमाओं पर काबू. इसके अलावा, कोरल से उत्सर्जन प्रोफाइल के प्रेतसंबंधी chromatophores और संश्लेषक zooxanthellae के बीच अपने चरम उत्सर्जन और विविधताओं की पहचान करने का संकल्प लिया गया. इन परिणामों के प्रयोग विधि के संदर्भ और अधिग्रहण के समय के बारे में अपने व्यक्तिगत लाभ, विश्लेषण समय, और Str समझौता किए बिना ठीक संरचनात्मक विवरण को हल करने की क्षमता में मूल्यांकन किया गयामूंगा ऊतक के uctural अखंडता.Protocol
Representative Results
Discussion
कोरल रीफ अनुसंधान समुद्री वातावरण में काम करते हैं कि एक साथ भौतिक, रासायनिक का विश्लेषण, और जैविक घटना से जुड़े, एक अत्यधिक अंतःविषय अनुसंधान प्रयास है. जटिल मूँगे की चट्टान पारिस्थितिकी प्रणालियों ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
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