In vivo avbildning av Dauer specifika Neuronal Remodeling i C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

Mekanismerna som kontrollerar stress fenotypisk plasticitet hos djur är ofta komplexa och svåra att studera in vivo. Ett klassiskt exempel på stressframkallad plasticitet är dauer skede av C. elegans. Dauers är en alternativ utvecklingslarvstadiet bildas under förhållanden med låga koncentrationer av bakteriell mat och höga koncentrationer av en dauer feromon. Dauers visar omfattande utvecklings och beteende plasticitet. Till exempel kan en uppsättning av fyra inner-labial kvadranten (IL2Q) nervceller genomgår omfattande reversibel ombyggnad under dauer bildning. Använda den välkända miljö vägar regler dauer posten, en tidigare etablerad metod för framställning av rå dauer feromon från storskaliga flytande nematod kulturer demonstreras. Med den här metoden, en koncentration av 50.000 – är tillräcklig för att ge en mycket potent rå dauer feromon 75.000 nematoder / ml flytande kultur. Rå feromon potens är determined av en dos-respons-bioanalys. Slutligen är de metoder som används för in vivo tidsförlopp avbildning av IL2Qs under dauer bildning beskrivs.

Introduction

Fenotypisk plasticitet, inbegripet utvecklings och beteende plasticitet, är viktigt för anpassning till ogynnsamma miljöförhållanden och anses vara en drivande kraft i evolutionen ^1. C. elegans är en modellorganism som ofta används för studier i utveckling och neurobiologi. Under ideala förhållanden C. elegans utvecklas genom fyra larvstadier innan de kommer in i vuxen reproduktiva stadiet. Men under förhållanden med låg tillgång på foder och hög befolkningstäthet, C. elegans kan genomgå en utvecklings switch och ingå en långlivad och stresståliga dauer etapp ^2. Dauers visa flera morfologiska och beteendemässiga skillnader från icke-dauers vilket sannolikt förmedlar denna stresstålighet. Miljököer och genetiska signalvägar som reglerar dauer posten har utförligt beskrivits ^{3, 4, 5, 6, 7.} Men de molekylära mekanismer som styr enskilda fenotypiska förändringar som sker dnder dauer bildning är mindre väl förstådd.

Undersökningen av Dauer specifika fenotyper kräver produktionen av Dauer djur. Detta kan åstadkommas på tre sätt: 1) Plocka från en starved kultur av C. elegans, 2) Användning av dauer bildning konstitutiv (daf-c) mutanter, 3) Induktion av dauer bildning genom renat feromon. Det är relativt enkelt att plocka dauers från en vanlig NGM platta med ett C. elegans befolkning som har förbrukat sin bakterielivsmedelsförsörjning. I våra händer, en standard NGM tallrik ursprungligen ympats med 50 pl OP50 Escherichia coli, som tillåts växa i 3 dagar och därefter ympats med 3-4 vuxna hermafroditer hålls vid 25 ° C kommer att uttömma livsmedelsförsörjningen inom en vecka och producera flera tusen dauers inom ytterligare 3 dagar (förutom många utsvultna icke dauers). Men denna metod otillfredsställande för undersöka processer som sker under molt i dAuer. Det är svårt att avgöra vilken av de flera tusen djur på en typisk svalt platta går in i Dauer. Vidare användning av ett svalt platta ger ingen möjlighet för synkronisering. Användningen av daf-c-mutanter möjliggör synkronisering och tillförlitlig alstring av dauers. Det finns dock ingen garanti för att en viss daf-c mutationen inte att påverka andra Dauer specifika fenotyper ensamma eller i kombination med ytterligare mutationer.

Närvaron av en dauer feromon först följer av Cassada och Russell och senare visas av Golden och Riddle. Den dauer feromon har sedan dess kemiskt karakteriseras ^{2, 8, 9, 10.} Det renade feromon består av en komplex blandning av ascarosides, som i olika former reglerar både beteende-och utvecklingsprocesser ^9, tillåter ^11. Användning av en rå dauer feromonextrakt för tillförlitlig kontrollerad induktion av synkroniserade dauers i en vildtyp bakgrund. </p>

Nervsystemet och tillhörande gliaceller genomgår ombyggnad under dauer larv formation ^{12, 13, 14.} Några av dessa förändringar är irreversibla, till exempel ombyggnad av gliaceller under dauer ^{13, 14.} Men andra remodeling händelser är reversibla vid en återgång till gynnsamma miljöförhållanden. Till exempel en uppsättning av fyra IL2Q nervceller genomgår en snabb och reversibel neuronal ombyggnad under dauer bildningen inklusive: Dendrite arborization, en övergång från enstaka dendritiska till multidendritic neuron och axon remodeling ^12. Metoderna häri möjliggöra tillförlitlig in vivo imaging stress-inducerad neuroplasticitet i en modellorganism. De metoder som presenteras för produktion och testning av rå dauer feromon är tidigare beskrivits och sammanställts från flera källor ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. Rå Dauer Pheromone Produktion Väx OP50 E. coli från en enda koloni O / N vid 37 ° C under skakning i 100 ml LB-buljong vid 200 rpm. OBS: Denna O / N-kulturen kan göras i förväg och lagras vid 4 ° C. Väx N2 C. elegans på Juni 15-20 cm petriskålar med NGM agar (Se recept i tabell 1) ympas med 50 ul av OP50 E. coli tills bakterierna är nästan slut 19. Gör 5x 250 ml S-media (se recept i tabell 1) i en L Erlenmeyerkolvar 19. OBS:…

Representative Results

Produktionen av rå dauer feromonresulterar i en gul vätska (Figur 1) som är både värme och kyla stabila. Lika delar av rå feromon lagras vid -20 ° C på obestämd tid utan någon uppenbar förlust i verksamheten. Efter produktionen av feromon är en enda dos-respons bioanalys tillräcklig för en grov uppskattning av potens. Emellertid är det för de flesta experiment nödvändigt att upprepa bioanalysen 2-3 gånger och ta ett genomsnitt från varje experiment. Representativa resultat från två…

Discussion

En undersökning av dauer specifika neuroplasticity och andra Dauer associerade morfologiska förändringar kräver kontrollerad och tillförlitlig bildning dauers antingen genom genetisk mutation (dvs, daf-c-mutanter) eller genom exponering av vildtyp djur till feromon. Medan användningen av en genetisk mutation för att inducera dauers är praktiskt, kan det confound resultat. Därför uppgifter som samlats in med daf-c mutationer bör därefter bekräftats med vildtyp djur inducerade att komma in i…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving