Cultures organotypique de tranche d'étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

Résumé

Une technique d’étude des cellules NG2 et des oligodendrocytes à l’aide d’un système de culture en tranches du cerveau antérieur et du cervelet est décrite. Cette méthode permet d’examiner la dynamique de prolifération et de différenciation des cellules au sein de la lignée des oligodendrocytes où l’environnement extracellulaire peut être facilement manipulé tout en maintenant la cytoarchitecture tissulaire.

Résumé

Les cellules exprimant NG2 (polydendrocytes, les cellules précurseurs d'oligodendrocytes) sont la quatrième grande population de cellules gliales dans le système nerveux central. Au cours du développement embryonnaire et postnatal elles prolifèrent activement et génèrent oligodendrocytes myélinisantes. Ces cellules ont souvent été étudiés dans des cultures primaires dissociées, co-cultures de neurones, et dans le tissu fixe. Utilisation de lignées de souris transgéniques nouvellement disponibles tranche systèmes de culture peuvent être utilisés pour étudier la prolifération et la différenciation des cellules de la lignée des oligodendrocytes dans les deux régions de la matière grise et blanche du cerveau et le cervelet. Cultures tranches sont préparées à partir de souris postnatales et sont maintenues en culture pendant 1 mois. Ces rondelles peuvent être imagées à plusieurs reprises au cours de la période de culture cellulaire pour étudier le comportement et les interactions. Cette méthode permet la visualisation de la division cellulaire NG2 et les étapes menant à la différenciation des oligodendrocytes, tout en permettant une analyse détaillée de région dépendent cellules oligodendrocytes et NG2 hétérogénéité fonctionnelle. Ceci est une technique puissante qui peut être utilisé pour étudier les signaux intrinsèques et extrinsèques qui influent sur ​​ces cellules au cours du temps dans un environnement cellulaire qui ressemble étroitement à celle trouvée in vivo.

Introduction

Cultures tranche Organoytpic du système nerveux central se sont avérées extrêmement utiles pour l'étude de la biologie des neurones et des cellules gliales dans un système ^{semiintact: 1 - 4.} Ces cultures sont relativement simples à adopter et à conserver de nombreux avantages des cultures de cellules dissociées primaires telles que la manipulation de l'environnement extracellulaire et un accès facile pour l'imagerie des cellules vivantes à long terme répétées et des enregistrements électrophysiologiques ^{5 - 9.} En outre, des cultures de tranches de tissu cytoarchitecture maintenir en 3 dimensions, la connectivité neuronale régionale, ....

Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux suivent les directives et ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université du Connecticut.

NOTE: Pour ces expériences constitutifs NG2cre ¹⁸ (JAX # 008533) et inductibles NG2creER ¹⁶ (JAX # 008538) de souris transgéniques a traversé à Z / EG ¹⁹ (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP reporter ²⁰ (JAX # 006148) lignes respectivement ont été utilisés à l'image des cellules NG2 et de leur progéniture. Pour l'image oligodendrocytes matures, PLPDsRed souris transgéniques ²¹ ont été utilisés. Pour la survie compatibles,....

Résultats

Des exemples de données représentatives sont donnés ci-dessous qui ont été obtenus à partir de cultures de tranche de la fois le cerveau et le cervelet de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP et PLPDsRed lignées de souris transgéniques. Cellules NG2 peuvent être visualisés sur plusieurs jours dans du cerveau antérieur et le cervelet tranches (figure 1B-D, la vidéo 1) et le phénotype de ces cellules peut être déterminé qu'après la fixation et immunologique avec des anticorps NG2 et CC1 (figure 1E).

Discussion

La myélinisation dans le système nerveux central est essentiel pour une communication efficace neuronale et la survie des axones ^22. Cellules NG2 génèrent en permanence des oligodendrocytes myélinisantes à l'âge adulte, tout en maintenant une population résidente dans la plupart des régions du cerveau ^{16,23 - 25.} Certains mécanismes génétiques et moléculaires qui régulent la différenciation de ces cellules ont été décrits, mais beaucoup reste à découvrir. Cultures organotypique sont un outil co.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu de culture en tranches
Minimum Essentiel	Invitrogen	11090	50 %
Hank' s Solution saline équilibrée	Invitrogen	14175	25 %
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034	25mM
L-Glutamine	Invitrogen	25030	1mM
Insuline	Sigma-Aldrich	I6634	1mg/L
Acide ascorbique	Sigma-Aldrich	A-0278	0.4mM
Sérum de cheval	Hyclone	SH30074.03	25 %
Titrer à pH 7,22 avec du NaOH, filtrer avec un filtre sur le dessus de la bouteille et stocker à 4 degrés Celsius
Dissection Buffer
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	124mM
KCl	Sigma-Aldrich	P5405	3.004mM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	1.25mM
MgSO4 (anhydre)	Sigma-Aldrich	M7506	4.004mM
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	C7902	2mM
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	26mM
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	10mM
Acide	ascorbiqueSigma-Aldrich	A-0278	2.0mM
Adénosine	Sigma-Aldrich	A4036	0.075mM
Filtre avec filtre sur le bouchon de la bouteille et stocker à 4 degrés Celsius, oxygéner avec 95 %O2 5 %CO2 avant utilisation
Autres réactifs et fournitures
4-hydroxy tamoxifène (4OHT)	Sigma-Aldrich	H7904	100nM
Paraformaldéhyde (PFA)	EM Sciences	19200	4 %
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L-6027	0.1M
Métaperiodate de sodium	Sigma-Aldrich	S-1878	0.01M
Anticorps anti NG2 de lapin	Chemicon (Millipore)	AB5320	1:500
Anticorps anti CC1 de souris	Calbiochem (Millipore)	OP80	1:200
Anticorps anti-Ki67 de souris	Vision Biosystems	NCL-Ki67-MM1	1:300
Anticorps anti-NeuN de souris	Chemicon (Millipore)	MAB377	1:500
Anticorps secondaires spécifiques à l’espèce	Jackson Immunoresearch
Sérum de chèvre normal (NGS)			5 %
Triton X-100			0.10 %
Milieu de montage avec inserts de membrane de culture millicellulaire DAPI	Vector Labs	H-1200
0,45&mu ; Fisher	Scientific	PICM03050
Filtres à bouchon de bouteille	Fisher Scientific	09-740-25F
Éthanol
95 % O2 5 % CO2 mélange
Phosphate Saline tamponnée (PBS)
Stérile à six puits
Spatules de dissection (hippocampe) ou de pesée Hachoir
			à tissus manuel ou automatique
Lames de
Pipettes de transfert jetables
Boîtes de Pétri stériles de 35 mm et 60 mm Stéréomicroscope
Phase inversée Microscope
Pare-agrumes à flux laminaire Incubateur
culture tissulaire
			fluorescence inversée

gazeuxrasoir de Microcope à