تحسن في جل β-القضاء الشامل للO-ربط وسلفو-glycomics الاختزالية التي كتبها الطيف الكتلي
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
بالغليكوزيل هو بروتين آخر متعدية التعديل الضروري، والمساهمة في الفيزيولوجيا العضوي، علم أمراض الأنسجة، والاعتراف الخلوي 1-3. على الرغم من التقدم الكبير في glycoscience التحليلي، تميز التنوع الكامل للglycans على بروتين معين لا يزال مهمة صعبة للغاية، خصوصا على البروتينات المعزولة من المصادر البيولوجية الأولية. ومع ذلك، فإن microheterogeneity من glycans سكري يؤثر كثيرا تفاعلات وظيفية مع بروتينات أخرى. لذا، وتوصيف التنوع غليكان ضروري لفهم مغزى الفسيولوجية الخلوية والأنسجة بالغليكوزيل 4،5. من أجل فهم مساهمة سكري بالغليكوزيل لعلم وظائف الأعضاء والأنسجة الفيزيولوجيا المرضية وقوية وحساسة، والتقنيات التحليلية glycomic شاملة أصبحت ذات أهمية متزايدة. في تحليل البروتين، وتتحقق التعرف البروتين عموما LC-MSتحليل / MS من الببتيدات زيتية 6. يمكن أن يتم هضم البروتين من استخدام البروتين أو البروتينات المنقى حلها بواسطة SDS-PAGE التالية في جل الهضم مع البروتياز مثل التربسين 7-9. قبل التخصيب للخليط البروتين بواسطة SDS-PAGE يعزز من عمق ودقة ID البروتين. تطوير استراتيجيات مماثلة لتحليل glycomic من بروتين سكري بالغليكوزيل تكمن في طليعة glycoscience.
وتعلق الطبقات الكبرى اثنين من glycans العمود الفقرى للبروتين إما من خلال N-O-الربط أو الربط. وتعلق glycans N-مرتبطة الأسباراجين (الأسباراجين) وجدت بقايا كجزء من sequon يعرف الأسباراجين-X-سر / منتدى المجالس الرومانسية / السيستئين (X هو أي الأحماض الأمينية إلا البرولين)، ويمكن أن تنطلق من الهضم الأنزيمي مع peptide- N -glycanase (PNGaseF أو A)، إما في الحل، في هلام، أو على لطخة 10-12. وترد glycans مرتبطة أساسا ليا سيرين (سر) أو ثريونين (THR) المخلفات. ومع ذلك، فقد تم الاتساع إنزيم واحد فقطtified التي هي قادرة على اطلاق سراح glycans مرتبطة يا من بروتين سكري ولها خصوصية غليكان محدودة للغاية، والإفراج فقط أبسط glycans مرتبطة الإخراج. تبقى استراتيجيات الإفراج الكيميائية الأسلوب المفضل لإطلاق شامل للglycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية. الاختزالية أو غير الاختزالية β-القضاء، أو hydrazinolysis وتقنيات الافراج كيميائية تتميز كذلك وحاليا الأكثر شيوعا نهج لإطلاق glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية 13،14. على الرغم من التخفيض β-القضاء قد استخدمت لإطلاق glycans مرتبطة يا من بروتينات سكرية مفصولة SDS-PAGE، النهج السابقة تقتضي الفصل HPLC لتحليلها لاحقا 15-17.
يوفر متعدد الأبعاد MS (MS ن) التحليل حاليا أغنى مصدر البيانات الهيكلية للتميز glycans صدر من بروتينات سكرية معزولة في المبالغ المتوقعة من معظم المصادر البيولوجية. عمق MSوالتوصيف الهيكلي المستندة سهلت كثيرا permethylating وglycans صدر قبل تحليلها. Permethylation يعزز التأين ويميل إلى معادلة ردود إشارة المولي عبر مجموعة واسعة من الهياكل غليكان 18،19. بالإضافة إلى ذلك، permethylation الكلمات بشكل لا لبس فيه الأنصاف أحادي السكاريد الطرفية واستبداله مع الجماهير مميزة، وبالتالي تعزيز توضيح الهيكلي 20-23. على سبيل المثال، glycans الحمضية يصعب عادة للكشف عن الأنواع غير permethylated التي كتبها MS. على الرغم من glycans الحمضية يمكن اكتشافه في وضع الأيونات السالبة التي كتبها MS، فإنه من المستحيل للكشف عن كل من glycans الحمضية ومحايدة في وضع ايون نفسه. والميزة الرئيسية لpermethylation غليكان هي التي سيتم توج كل من مجموعات الهيدروكسيل مجانية (OH) على بدائل أحادي السكاريد وغليكان مع مجموعة الميثيل (OCH 3 أو OME)، وبذلك يتم تحييد التهم لغليكان sialylated، وجعلها كما كشفها كما permethylated محايد (آسيالو) glycans. ومع ذلك، فإن الهيدروكسيل من الأنصاف سلفات على sulfoglycans تقاوم permethylation، مما أدى إلى الإبقاء على تهمة أنيوني، الذي يقمع التأين ويقلل الحساسية. هذا القمع يمنع حاليا glycomic تحليل شامل للبروتينات سكرية معقدة جدا مثل mucins، التي تحمل فرة عالية من glycans مكبرت 24-26.
التقارير الأخيرة على تنقية مكبرت glycans استخدمت اتهم، عكس المرحلة اللوني لتنقية وglycans permethylated منفصلة قبل تحليل MALDI. تعتمد هذه الطريقة على الفصل التام بين glycans مكبرت وغير مكبرت باستخدام مراحل النقالة المختلفة للشطف، والتي وجدنا أن تكون أقل صرامة من مرحلة التقسيم العضوي. وبالتالي، يتم عرض تقنيات جديدة مناسبة للكشف وإثراء sulfoglycans هنا. هذه التقنيات تسمح لاسترداد الكمي للglycans مكبرت في المرحلة المائية التالية الماء: • قرار مجلس الوزراء (ثنائي كلورو ميثان)استخراج، والتي تتم بشكل روتيني في نهاية التفاعلات permethylation غليكان 27. الأهم من ذلك، هذا الفصل قوي من sulfoglycans permethylated من خليط من permethylated glycans غير مكبرت يثري متزامنة للأنواع مشحونة مع تبسيط MS 2 أنماط التجزئة. ويرد أيضا على بروتوكول شامل لتحسين مرتبطة يا التحليل غليكان في هلام. تحسن بروتوكول يعزز الانتعاش غليكان، ويزيد من المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال الهيكلية MS ن تحليل glycans permethylated، ويحسن حساسية التحليلات sulfoglycomic تطبيقها على بروتينات سكرية أساسية معزولة من مصادر بيولوجية.
ويهدف هذا البروتوكول لتحليل مرتبطة يا غليكان مقتطفات سكري بأكملها أو من بروتين سكري معين من الفائدة حلها بواسطة SDS-PAGE ويتكون من ثلاثة الإجراءات التجريبية. A) جل التنظيف، B) في جل التخفيض β-القضاء، وC) permethy غليكانlation. الهدف هو الحصول على بيانات شاملة مرتبطة يا glycomic عن بروتينات سكرية تحصد من المصادر الأولية من الفائدة البيولوجية (الشكل 1). وتصور البروتينات السكرية مفصولة SDS-PAGE من قبل تلطيخ ويتم استئصال عصابات من الفائدة وشرائح الناتجة الفرقة هلام الى قطع صغيرة. وdestained القطع جل وتعرض لغسيل خلات الإيثيل لإزالة الملوثات هلام (الشكل 2A). ويتحقق الإفراج غليكان من قبل في جل التخفيض β-القضاء (الشكل 2B) وpermethylated وglycans الافراج عنهم. استخراج مائي العضوي permethylation التالية أقسام كميا أنيوني مكبرت glycans بعيدا عن glycans محايدة غير مكبرت (الشكل 2C). في جل التخفيض β-القضاء إلى جانب استخراج مائي العضوي يمكن توصيف glycans مرتبطة يا وsulfoglycans صدر من كميات صغيرة من بروتين سكري مفصولة SDS-PAGE. نظرة عامة على الاستراتيجية هي summariوتظهر زيد في الشكل 1 والتفاصيل في الشكل (2). وبالإضافة إلى ذلك، جزء من القطع هلام destained وغسلها يمكن استخدامها لمعرف البروتين من خلال تقنيات البروتين LC-MS / MS القياسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
