Amélioration dans le gel sulfo-réductrices glycomique β-élimination complète pour O-liés et par spectrométrie de masse

Résumé

Afin d’explorer de manière exhaustive la diversité des glycanes liés à l’O, une nouvelle procédure d’élimination β réductrice en gel, combinée à la perméthylation et à une méthode de partage de phase rapide, est appliquée à l’analyse des glycanes liés à l’O directement libérés des glycoprotéines résolues par SDS-PAGE et pouvant faire l’objet d’une analyse glycomique ultérieure par spectrométrie de masse.

Résumé

La séparation des protéines par SDS-PAGE, suivie d’une digestion protéolytique en gel des bandes de protéines résolues, a produit une analyse protéomique à haute résolution des échantillons biologiques. Des approches similaires, qui permettraient une analyse approfondie des glycanes transportés par les glycoprotéines résolues par SDS-PAGE, nécessitent des considérations particulières afin de maximiser la récupération et la sensibilité lors de l’utilisation de la spectrométrie de masse (MS) comme méthode de détection. L’un des principaux obstacles à surmonter pour obtenir des données de haute qualité est l’élimination des contaminants dérivés du gel qui interfèrent avec l’analyse MS. Le flux de travail d’échantillons présenté ici est robuste, efficace et élimine le besoin d’un nettoyage HPLC en ligne avant la MS. Les morceaux de gel contenant des protéines cibles sont lavés dans de l’acétonitrile, de l’eau et de l’acétate d’éthyle pour éliminer les contaminants, y compris les fragments d’acrylamide polymérique. Les glycanes liés à l’O sont libérés des protéines cibles par β-élimination réductrice dans le gel et récupérés par des procédures de nettoyage simples et robustes. L’un des avantages de ce flux de travail est qu’il améliore la sensibilité pour la détection et la caractérisation des glycanes sulfatés. Ces procédures produisent une séparation efficace des glycanes perméthylés sulfatés des glycanes perméthylés non sulfatés (sialylés et neutres) par une partition de phase rapide avant l’analyse MS, et améliorent ainsi les analyses glycomiques et sulfoglycomiques des glycoprotéines résolues par SDS-PAGE.

Introduction

La glycosylation est une modification de post-traductionnelle des protéines essentielles, ce qui contribue à la physiologie organismal, la pathologie des tissus, et de la reconnaissance cellulaire ^3.1. Malgré les importants progrès glycoscience analyse, la caractérisation de la diversité complète des glycanes sur une protéine spécifique reste une tâche extrêmement difficile, en particulier sur les protéines isolées à partir de sources biologiques primaires. Néanmoins, la microhétérogénéité de glycanes des glycoprotéines affecte fréquemment les interactions fonctionnelles avec d'autres protéines. Par conséquent, la caractérisation de la diversité glycan....

Protocole

NOTE: Les préoccupations de sécurité en laboratoire

Conformément aux meilleures pratiques de laboratoire standard, respectez les consignes suivantes. Conservez tous les solvants organiques dans des endroits appropriés. Gardez tous les déchets dans des conteneurs de déchets chimiques avec un étiquetage clair des compositions chimiques. Comme plusieurs réactifs utilisés dans ces protocoles sont potentiellement cancérigènes ou générer des gaz combustibles volatils, traiter tous les réactifs dans une hotte avec ventilation. Porter un équipement de protection individuelle comme des gants, une blouse de laboratoire et des lunet....

Résultats

Effet de Ethyl Acetate Traitement Avant In-gel réducteur β-élimination

Un spectre de masse représentatif d'échantillons de glycane O-liés perméthylés libérés par bovine mucine à l'aide de gel de β-élimination réductrice est représenté sur la Figure 3. Le lavage à l'EtOAc des morceaux de gel élimine efficacement SDS et polyacryliques contaminants qui interfèrent avec l'analyse MS ultérieure ^27.

Discussion

La combinaison de la β-élimination réductrice en gel avec l’extraction organique aqueuse améliore la sensibilité et la profondeur des données structurales qui peuvent être acquises pour caractériser les glycanes liés à l’O sulfatés et non sulfatés récoltés à partir de petites quantités de glycoprotéines de type mucine résolues à partir d’autres protéines par SDS-PAGE. Les principales avancées des approches techniques présentées dans cette étude sont les suivantes : a) élimination facile des contaminants dérivés du gel pa.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Eau, eau déminéralisée	Sigma-Aldrich  ;	270733-4L	CHROMASOLV, pour l’acide acétique HPLC
, Glacial	Fisher	A38-500	Certifié ACS &ge ; 99,7 % p/p
Méthanol	Sigma-Aldrich  ;	34860-4L-R	CHROMASOLV, pour HPLC, &ge ; 99.9 %
Bicarbonate d’ammonium	Fluka	09830-500G	BioUltra, &ge ; 99,5 % (T), étape 1
Acétonitrile	Sigma-Aldrich  ;	34998-4L	CHROMASOLV Plus, pour HPLC, &ge ; 99,9 %, Etape 1
Acétate d’éthyle	Fluka	34972-1L-R	LC-MS CHROMASOLV, Etape 1
Borohydrure de sodium	Aldrich	213462-25G	ReagentPlus, 99 %, Etape 2
Iodométhane	Sigma-Aldrich  ;	289566-100G	ReagentPlus, 99,5 %,  ; Étape 6. Conserver à 4 ° ; C jusqu’à l’utilisation. Laisser reposer à température ambiante avant utilisation.
Solution d’hydroxyde de sodium, 50 % p/p	Fisher	SS254-1	, étape 6
Diméthylsulfoxyde anhydre	Sigma-Aldrich.	276855-1L	Anhydre, &ge ; 99,9 %, Étape 6
Méthanol anhydre	Sigma-Aldrich  ;	322415-100ML	Anhydre, 99,8 %, Étape 6
Dichlorométhane	Sigma-Aldrich  ;	34856-4L	CHROMASOL® ;, pour HPLC, &ge ; 99,8 %, contient de l’amylène comme stabilisant, Étape 7
Dowex 50WX8 forme d’hydrogèneforme d’hydrogène 100-200  ; maille	Sigma-Aldrich  ;	217506-500G	Step 3
AG 50W-X8 Résine  ;	Bio-Rad	142-1441	Étape 3
BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Colonne d’extraction en phase solide, PP, Octadécyle (C18) Phase inverse	JT Baker	JT-7020-01	Étape 5 et 8
7,5 % Mini-PROTEAN TGX Gel préfabriqué  ;	Bio-Rad		Étape 1
Teinture de Coomassie Bio-Safe  ;	Bio-Rad	161-0786	G-250, Étape 1
Kit de coloration d’argent pour spectrométrie de masse	Pierce	24600	Étape 1
Kit d’oligosaccharides (maltotroiose, Dp3 : R474140)	Supelco  ;	47265
Kit d’oligosaccharides (maltotétraose, Dp4 : R474135)	Supelco  ;	47265
Pipettes Pasteur jetables, verre, pointe courte	VWR	14673-010	Laver avant utilisation
PYREX 13 x 100 mm Tubes de culture filetés jetables à fond rond	Corning	99447-13	Laver avant utilisation
PYREX 16 x 125 mm Tubes de culture filetés jetables à fond rond	Corning	99447-16	Laver avant utilisation
Capuchons/fermetures phénoliques avec revêtement en caoutchouc recouvert de PTFE	Kimble	45066C-13	Laver avant utilisation
Capuchons/fermetures phénoliques avec doublure en caoutchouc PTFE	Kimble	45066C-15	Laver avant utilisation
Seringue HPLC Hamilton	HAMILTON	81265	volume 500  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22 G
Seringue HPLC Hamilton	HAMILTON	81165	volume 250  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22 G
Seringue HPLC Hamilton	HAMILTON	81065	volume 100  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22s G
Hamilton Seringue HPLC	HAMILTON	80965	volume 50  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 22s G
Hamilton Seringues calibrées	HAMILTON	80300	volume 10  ; &mu ; l, taille de l’aiguille 26s G
Boîte de Pétri Verre 100 mm x 15mm	GSC INTERNATIONAL INC	1500-4	Laver avant utilisation, Étape 1
Lames chirurgicales Bard-Parker	Fisher	371310	Étape 1
Module de chauffage/agitation Reacti-Therm	Pierce	18870	Étape 1, 4 et 7
Blocs chauffants	Fisher	125D	Étape 2
Fibre de verre Pyrex laine borosilicate pore taille 8  ; &mu ; m	Aldrich	CLS3950	Étape 3
Coupe-silice fondueCoupe-tube	alltech	3194	Étape 3
Vortex multitubes  ;	VWR	444-7063	Étape 6
Lyophiliseur 25EL Freezemobile	Virtis	25EL
Centrifugeuse	VWR	Clinical 50
LTQ Orbitrap Discovery	Thermo Fisher Scientific

certifiée