질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
글리코 실화는 유기체 생리학, 조직 병리학, 및 셀룰러 인식 1-3에 기여 필수적인 단백질 번역 후 변형이다. 분석, 당질의 주요 발전에도 불구하고, 특정 단백질에 글리 칸의 전체 다양성을 특징 짓는 특히 차 생물 소스에서 고립 된 단백질에, 매우 어려운 과제 남아있다. 그럼에도 불구하고, 당 단백질 글리 칸의 microheterogeneity 자주 다른 단백질과 기능의 상호 작용에 영향을 미친다. 따라서, 글리 칸 다양성의 특성화 세포 및 조직 당화 4,5의 생리적 중요성을 이해하는데 필수적이다. 조직의 생리 및 병태 생리, 강력한 민감하고 포괄적 인 glycomic 분석 기술에 당 단백질 글리코 실화의 기여를 이해하기 위해 점점 더 중요 해지고있다. 단백질체 분석에서 동정 된 단백질은 일반적으로 LC-MS에 의해 달성된다/ 트립신 펩티드 (6)의 MS 분석. 단백질 분해는 7-9의 트립신과 같은 프로테아제의 겔 소화 다음 SDS-PAGE에 의해 해결 정제 된 단백질 또는 단백질을 사용하여 수행 될 수있다. SDS-PAGE에 의해 단백질 혼합물의 예비 농축 단백질 ID의 깊이와 정확도를 향상시킨다. 당 단백질의 당화의 glycomic 분석을위한 유사한 전략의 개발은 당질의 최전선에있다.
글리 칸의 두 가지 주요 클래스는 N-O 결합 또는 쇄교 어느 통해 단백질 골격에 부착된다. N 연결된 글리 칸은 아스파라긴에 부착된다 아스파라긴 (Asn)에서 Asn-X-빼앗아 /의 Thr / Cys이고 정의 sequon의 일부로서 발견 잔기 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 임), 및 펩티드 – N과 효소 절단에 의해 해제 될 수있다 -glycanase (PNGaseF 또는 A), 하나 솔루션에서 젤, 또는 온 오점 10-12. O 연결 글리 칸은 주로 세린 (SER) 또는 트레오닌 (THR) 잔기에 부착된다. 그러나, 단지 하나의 효소 IDEN되었습니다당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출 할 수 있고, 그것은 단지 간단한 O 연결 글리 칸을 방출 극히 제한 글리 칸으로 발견 된 특이성을 갖는다. 화학 릴리스 전략은 당 단백질의 O 연결 글리 칸의 종합 릴리스에 대한 선택의 방법 남아있다. 환원성 또는 비 환원성 β-제거, 또는 하이드라진 잘 특성화 된 화학 분리 기법이며, 당 단백질 (13, 14)에서 O 연결 글리 칸을 해제하기위한 가장 널리 사용되는 방식은 현재. 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출하기 위해 사용되었지만, 이전 접근법은 15-17 후속 분석을 위해 HPLC 분리를 요구했다.
다차원 MS (MS N) 분석은 현재 대부분의 생물학적 소스에서 예상되는 금액에 고립 된 당 단백질에서 방출 된 글리 칸의 특성에 대한 구조적 데이터의 가장 부유 한 소스를 제공합니다. MS의 깊이기반 구조 특성이 크게 전에 그들의 분석 글리 칸을 방출 permethylating에 의해 촉진된다. 메틸화는 이온화를 개선하고 글리 칸 구조 (18, 19)의 넓은 범위에 걸쳐 몰 응답 신호를 등화시키는 경향이있다. 또한, 메틸화는 모호하여 구조적 해명 20-23 향상 특유 매스와 단자 및 치환 단당 잔기를 붙인다. 예를 들어, 산성 글리 칸은 MS에 의해 비 메틸화 종으로 감지 할 수 일반적으로 어렵다. 산성 글리 칸이 MS에 의해 마이너스 이온 모드에서 검출 될 수 있지만, 동일한 이온 모드에서 모두 산성 및 중성 글리 칸을 검출하는 것은 불가능하다. 글리 칸 메틸화의 큰 장점은 메틸화로 글리 칸의 단당류 치환체에 자유 수산기 (OH)가 모두 그들로서 검출하게 메틸기 (OCH 3 또는 SID), 따라서 시알 릴화 된 글리 칸의 전하를 중화로 캡핑 될 것이라는 것이다 중립 (아시아LO) 글리 칸. 그러나, sulfoglycans에 황산 부분의 수산기는 이온화를 억제하고 감도를 감소 음이온 전하의 보존 결과, 메틸화에 저항. 이 억제는 현재 황산 글리 칸 24 ~ 26의 높은 풍요 로움을 가지고 같은 점액과 같은 매우 복잡한 당 단백질의 포괄적 인 glycomic 분석을 방지 할 수 있습니다.
정화 황산 글리 칸 최근 보고서는 역 위상 정화 크로마토 그래피 및 MALDI 분석에 앞서 별도의 메틸화 글리 칸, 충전에 사용됩니다. 이 방법은 우리가 유기 상 분할보다 덜 엄격한 것으로 나타났습니다 용출 다른 이동상을 사용하여 황산 및 비 황산 글리 칸의 완전한 분리에 의존한다. 따라서, sulfoglycans의 검출 및 농축에 적합한 새로운 기술이 여기에 제시되어있다. 이러한 기술은 다음과 같은 물 성상 황산 화 글리 칸의 정량적 복구 할 수 : DCM (디클로로 메탄)일상적 당쇄 메틸화 반응 (27)의 끝에서 수행된다 추출. 또한이 MS 단편화 패턴을 단순화 중요한 메틸화 비 설페이트 화 글리 칸의 혼합물로부터 메틸화 sulfoglycans이 견고한 분리 병용 하전 종 풍부. 개선에 – 겔 O 연결된 글리 칸 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 제공됩니다. 개선 된 프로토콜은, 글리 칸 회복을 향상 MS 통해 얻어지는 N 메틸화 글리 칸의 분석 구조 정보를 증가시키고 생물학적 공급원으로부터 격리 필수 당 단백질에인가 sulfoglycomic 분석의 감도를 향상시킨다.
이 프로토콜은 전체 당 단백질 추출물 O 연결된 글리 칸 분석을 위해 또는 SDS-PAGE에 의해 해결 관심 특정 당 단백질의 의도와 세 실험 절차로 구성된다; A) 젤 청소, B)에서 – 겔 환원 β-제거, 및 C) 글리 칸 permethy만큼은. 목표는 생물학적 관심 (그림 1)의 기본 소스에서 수확 당 단백질에 대한 포괄적 인 O-연결 glycomic 데이터를 획득하는 것입니다. SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질 염색 관심 대역 절제되고 결과 겔 밴드를 작은 조각으로 분리된다 시각화된다. 겔 조각 탈색 및 겔 오염물 (도 2a)를 제거 에틸 아세테이트 세척을 실시한다. 글리 칸 릴리스에 – 겔 환원 β-제거 (그림 2B)에 의해 달성되고 발표 된 글리 칸은 메틸화된다. 수성 유기 추출 다음과 메틸화 정량적으로 떨어져 비 황산 중립 글리 칸 (그림 2C)에서 음이온 성 황산 글리 칸을 분할한다. 에 – 겔 수성 유기 추출 결합 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질의 소량에서 방출 O 연결 글리 칸과 sulfoglycans의 특성을 수 있습니다. 전략적 개요 summari입니다도 1 및 세부 데이빗은도 2에 도시되어있다. 또, 탈색 및 세척 겔 조각 부는 표준 LC-MS / MS 단백체 기술에 의해 단백질 ID를 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
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