Forbedret i-gel reduktiv β-eliminering for Comprehensive O-forbundet og sulfo-glycomics ved massespektrometri
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Glykosylering er en viktig protein post-translasjonell modifikasjon, bidrar til organisme fysiologi, vev patologi, og cellegjenkjenning 1-3. Til tross for store fremskritt innen analytisk glycoscience, karakteriserer hele mangfoldet av glykaner på et bestemt protein er fortsatt en svært utfordrende oppgave, spesielt på proteiner isolert fra primære biologiske kilder. Likevel, mikroheterogenitet av glykoprotein glykaner ofte påvirker funksjonelle interaksjoner med andre proteiner. Derfor er vesentlig for forståelsen av den fysiologiske betydningen av cellulært vev og glykosylering 4,5 karakterisering av glykan diversitet. For å forstå bidrag av glykoprotein glykosylering til vev fysiologi og patofysiologi, robust, følsom, og omfattende glycomic analytiske teknikker har blitt stadig viktigere. I proteomikk analyse, blir protein identifikasjoner generelt oppnådd ved LC-MS/ MS-analyse av tryptiske peptider 6. Protein spaltning kan utføres ved hjelp av et renset protein eller proteiner løst ved hjelp av SDS-PAGE-gel i følgende spaltning med proteaser som trypsin 7-9. Pre-anrikning av proteinblanding ved hjelp av SDS-PAGE øker dybden og nøyaktigheten av protein ID. Utviklingen av analoge strategier for glycomic analyse av glykoprotein glykosylering ligger i forkant av glycoscience.
De to hovedklasser av glykaner er festet til protein stamnett gjennom enten N-lenke eller O-kobling. N-bundne glykaner er festet til asparagin (Asn) rester som finnes som en del av et definert som sequon Asn-X-Ser / Thr / Cys (X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin), og kan frigis ved enzymatisk spaltning med N peptid- -glycanase (PNGaseF eller A), enten i oppløsning, i-gel, eller on-blot 10-12. O-bundne glykaner er hovedsakelig festet til serin (Ser) eller treonin (Thr) rester. Imidlertid har bare ett enzym blitt Idenserte som er i stand til å frigjøre O-bundne glykaner fra glykoprotein, og det har en ekstremt begrenset glykan spesifisitet, og slipper bare de enkleste O-bundne glykaner. Kjemisk utslipp strategier forbli metoden for valg for omfattende utgivelsen av O-forbundet glykaner fra glykoproteiner. Reduktiv eller ikke-reduktiv β-eliminering, eller hydrazinolyse er godt karakteriserte kjemiske utslipp teknikker og er i dag de mest brukte metoder for å slippe O-forbundet glykaner fra glykoproteiner 13,14. Selv om reduktiv β-eliminering er blitt brukt til å frigjøre O-bundne glykaner fra glykoproteiner separert ved SDS-PAGE, tidligere tilnærminger HPLC-separasjon som kreves for etterfølgende analyse 15-17.
Flerdimensjonal MS (MS n) analyse gir i dag den rikeste kilden til strukturelle data for karakter glykaner løslatt fra glykoproteiner isolert i de mengder som forventes fra de fleste biologiske kilder. Dybden av MS–basert strukturell karakterisering er det mye lettere å permethylating de frigitte glykaner før sin analyse. Permethylation forbedrer ionisering og har en tendens til å utjevne molare signal responser over et bredt spekter av sukkerstrukturer 18,19. I tillegg permethylation entydig tags terminal og erstattet monosakkarid delene med karakteristiske massene, og dermed styrke strukturoppklaring 20-23. For eksempel sure glykaner er generelt vanskelig å oppdage som ikke-permethylated arter av MS. Selv om sure glykaner kan påvises i negativ ion-modus ved MS, er det umulig å påvise både sure og nøytrale glykaner i samme ion-modus. En stor fordel med glykan permethylation er at alle de frie hydroksylgrupper (OH) på et glykan s monosakkarid-substituenter vil være avkortet med en metylgruppe (OCH3 eller OMe), for således en sialyserte glykan for ladninger nøytralisert, noe som gjør dem så påvises som permethylated nøytral (asiaLO) glykaner. Imidlertid hydroksylene av sulfatrestene på sulfoglycans er motstandsdyktig mot permethylation, noe som resulterer i bibeholdelse av anionisk ladning, som undertrykker ionisering og minsker følsomheten. Dette undertrykkelse hindrer tiden omfattende glycomic analyse av svært komplekse glykoproteiner som muciner, som bærer en høy overflod av sulfaterte glykaner 24-26.
Nye rapporter om rensing av sulfatert glykaner brukt belastet, reverse-fase kromatografi å rense og separate permethylated glykaner før MALDI analyse. Denne metoden er avhengig av fullstendig skille sulfaterte og ikke-sulfat glykaner ved hjelp av ulike mobilfaser for eluering, som vi har funnet å være mindre strenge enn organiske fasen partisjonering. Derfor er nye teknikker som er egnet for påvisning og berikelse av sulfoglycans presenteres her. Disse teknikker gjør det mulig for den kvantitative utvinning av sulfaterte glykaner i den vandige fasen etter vann: DCM (diklormetan)ekstraksjon, som blir rutinemessig utført ved slutten av 27 glykan permethylation reaksjoner. Viktigere, denne robuste separasjon av permethylated sulfoglycans fra en blanding av permethylated ikke-sulfat glykaner samtidig beriker for ladede arter samtidig forenkle MS 2 fragmentering mønstre. En omfattende protokoll for forbedret i-gel O-forbundet glycan analyse er også presentert. Den forbedrede protokollen forbedrer glycan utvinning, øker den strukturelle informasjoner gjennom MS n analyse av permethylated glykaner, og forbedrer følsomheten sulfoglycomic analyser anvendt på essensielle glykoproteiner isolert fra biologiske kilder.
Denne protokollen er ment for O-bundet glykan analyse av hele glykoprotein ekstrakter eller av et spesifikt glykoprotein av interesse løst ved hjelp av SDS-PAGE, og er sammensatt av tre eksperimentelle prosedyrer; A) gel opprydning, B) in-gel reduktiv β-eliminering, og C) glycan permethyning. Målet er å få omfattende O-forbundet glycomic data for glykoproteiner høstet fra primærkilder biologisk interesse (figur 1). Glykoproteiner separert ved SDS-PAGE er visualisert ved farging og bånd av interesse er skåret ut, og den resulterende gel båndet er oppskåret i små stykker. Gelstykkene blir avfarget og underkastet etylacetat vaskinger for å fjerne forurensninger gel (figur 2A). Glycan utgivelsen oppnås ved in-gel reduktiv β-eliminering (figur 2B) og de frigjorte glykaner er permethylated. Vandig-organisk ekstraksjon følgende permethylation kvantitativt partisjoner de anioniske sulfatert glykaner borte fra ikke-sulfat nøytrale glykaner (figur 2C). I-gel reduktiv β-eliminering koplet til vandig-organisk ekstraksjon muliggjør karakterisering av O-bundne glykaner og sulfoglycans frigjøres fra små mengder av glykoprotein separert ved SDS-PAGE. Den strategisk overblikk er summarized i figur 1, og detaljene er vist i figur 2. I tillegg kan en del av de avfarget og vaskes gelbitene bli brukt for protein ID ved standard LC-MS / MS proteomic teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
