Melhorou em-gel redutivas β-eliminação para Comprehensive O-ligados e sulfo-glycomics por Espectrometria de Massa
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
A glicosilação é uma modificação essencial de proteínas pós-tradução, contribuindo para a fisiologia do organismo, a patologia do tecido, e reconhecimento celular 1-3. Apesar dos grandes avanços na glycoscience analítica, caracterizando a diversidade completa de glicanos em uma proteína específica continua a ser uma tarefa extremamente desafiadora, especialmente em proteínas isoladas de fontes biológicas primárias. No entanto, o microheterogeneidade de glicanos glicoproteína freqüentemente afeta as interações funcionais com outras proteínas. Portanto, a caracterização da diversidade de glicano é essencial para compreender o significado fisiológico de 4,5 glicosilação celular e tecidual. A fim de compreender a contribuição de glicoproteína de glicosilação para a fisiologia e patofisiologia tecido, robusto, sensível e técnicas analíticas glycomic abrangentes tornaram-se cada vez mais importante. Na análise proteômica, identificações de proteína são geralmente alcançado por LC-MS/ MS de péptidos trípticos 6. Digestão de proteínas pode ser realizada utilizando uma proteína ou proteínas purificadas resolvidas por SDS-PAGE após digestão em gel com proteases tais como tripsina 7-9. Pré-enriquecimento da mistura de proteína por SDS-PAGE aumenta a profundidade e precisão de identificação de proteínas. O desenvolvimento de estratégias análogas para análise glycomic de glicoproteína glicosilação se encontra na vanguarda da glycoscience.
As duas principais classes de glicanos estão ligados a espinha dorsal de proteínas, quer através de ligação ou N-O-ligação. Glicanos ligados a N estão ligados a asparagina (Asn) resíduos encontrados como parte de um sequon definido como Asn-X-Ser / Thr / Cys (X é qualquer aminoácido excepto prolina), e pode ser libertado por digestão enzimática com N p�tido -glycanase (PNGaseF ou A), quer em solução, em gel, ou sobre-blot 10-12. Glicanos ligados a O estão ligados principalmente a serina (Ser) ou treonina (Thr) resíduos. No entanto, apenas uma enzima foi idenficada que é capaz de libertar os glicanos ligados em O de glicoproteína e tem uma especificidade de glicano extremamente limitada, libertando apenas os glicanos ligados em O mais simples. Estratégias de liberação química continuam sendo o método de escolha para a liberação completa de glicanos ligados em O de glicoproteínas. Β-eliminação redutiva ou não-redutora, ou hidrazinólise são técnicas de liberação química bem caracterizados e são atualmente as abordagens mais comumente usadas para a liberação glicanos ligados em O de glicoproteínas 13,14. Embora β-eliminação redutiva foi usado para libertar os glicanos ligados em O a partir de glicoproteínas separadas por SDS-PAGE, as abordagens anteriores necessária separação por HPLC para análise subsequente 15-17.
Análise multidimensional MS (MS n) fornece atualmente a mais rica fonte de dados estruturais para a caracterização de glicanos libertados de glicoproteínas isoladas nos valores esperados da maioria das fontes biológicas. A profundidade da EMcaracterização estrutural baseado é muito facilitada por permethylating os glicanos divulgados antes da sua análise. Permetilação aumenta ionização e tende a igualar as respostas sinal molares através de uma ampla gama de estruturas de glicano 18,19. Além disso, permetilação inequivocamente Tag metades monossacarídeos terminais e substituídos com massas distintas, aumentando assim elucidação estrutural 20-23. Por exemplo, glicanos ácidas são geralmente difíceis de detectar, como espécies não permetilado por MS. Embora glicanos ácidas pode ser detectado no modo de iões negativos por MS, é impossível detectar ambos os glicanos ácidas e neutras no mesmo modo de ião. Uma grande vantagem do permetilação glicano é que todos os grupos hidroxilo livres (OH) em substituintes de monossacárido de um glicano vai ser tapado com um grupo metilo (OCH3 ou OMe), assim taxas de sialilados de glicano são neutralizados, tornando-os como detectável como permetilado neutro (ásialo) glicanos. No entanto, os hidroxilos de metades de sulfato em sulfoglycans são resistentes a permetilação, resultando na retenção de carga aniónica, o qual suprime a ionização e diminui a sensibilidade. Esta supressão impede actualmente análise glycomic abrangente de glicoproteínas muito complexas tais como mucinas, que carregam uma alta abundância de glicanos sulfatados 24-26.
As recentes notícias sobre purificação sulfatada glicanos usado cobrado, cromatografia de fase reversa para purificar e glicanos permetilado separados antes da análise MALDI. Este método baseia-se na separação completa de glicanos sulfatados e não sulfatados com diferentes fases móveis para a eluição, o que temos encontrado para ser menos rigorosas do particionamento fase orgânica. Portanto, as novas técnicas adequadas para a detecção e enriquecimento de sulfoglycans são apresentados aqui. Estas técnicas permitem a recuperação quantitativa de glicanos sulfatados na fase aquosa de água seguinte: DCM (diclorometano)de extracção, que é realizado rotineiramente no final de reacções de glicano 27 permetilação. É importante ressaltar que esta separação robusto de sulfoglycans permetilado partir de uma mistura de glicanos não-sulfatados permetilado enriquece concomitantemente para espécies carregadas ao mesmo tempo, simplificando MS dois padrões de fragmentação. Também é apresentado um protocolo global para melhorar a análise de glicanos ligados-O em-gel. O protocolo melhorado aumenta a recuperação de glicano, aumenta a informação estrutural obtida através de análise de MS n glicanos permetilado, e melhora a sensibilidade das análises sulfoglycomic aplicadas às glicoproteínas essenciais isolados a partir de fontes biológicas.
Este protocolo destina-se a análise de glicano ligado em O de extractos de glicoproteínas integrais ou de uma glicoproteína específica de interesse resolvidas por SDS-PAGE e é composto por três procedimentos experimentais; A) gel de limpeza, B) redutora β-eliminação em gel, e C) permethy glycanlação. O objectivo é a obtenção de dados glycomic ligados a O abrangentes para glicoproteínas colhidas a partir de fontes primárias de interesse biológico (Figura 1). As glicoproteínas separadas por SDS-PAGE são visualizadas por coloração e as bandas de interesse são excisadas e a banda de gel resultante é cortado em pequenos pedaços. Os pedaços de gel são descorado e sujeito a lavagens de acetato de etilo para remover contaminantes de gel (Figura 2A). Libertação de glicano é conseguida por eliminação redutiva β-em-gel (Figura 2B) e os glicanos libertados são permetilado. Aquoso-orgânico de extracção seguinte permetilação quantitativamente particiona os aniónicos sulfatados glicanos longe de glicanos neutros não-sulfatados (Figura 2C). Em gel de redutiva-β-eliminação acoplado a extracção aquosa-orgânica permite a caracterização e de glicanos ligados em O sulfoglycans libertados a partir de pequenas quantidades de glicoproteína separadas por SDS-PAGE. A visão estratégica é summarized na Figura 1 e os detalhes estão apresentados na Figura 2. Além disso, uma porção dos pedaços de gel descorado e lavados pode ser utilizada para identificação da proteína por técnicas de proteómica LC-MS / MS padrão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
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