Улучшенные В-гель восстановительного β-Ликвидация для Комплексная О-связанные и сульфо-glycomics помощью масс-спектрометрии
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Гликозилирование является важным белком посттрансляционная модификация, способствуя организменном физиологии, ткани патологии и клеточной признания 1-3. Несмотря на значительные достижения в аналитической glycoscience, характеризующий полное разнообразие гликанах на специфического белка остается чрезвычайно сложной задачей, особенно на белки, выделенные из первичных биологических источников. Тем не менее, микрогетерогенность гликопротеина гликанов часто влияет функциональных взаимодействий с другими белками. Таким образом, характеристика гликана разнообразия имеет важное значение для понимания физиологическое значение клеточной и тканевой гликозилирования 4,5. Для того чтобы понять вклад гликопротеина гликозилирования к ткани физиологии и патофизиологии, надежной, чувствительной и комплексных glycomic аналитических методов становятся все более важными. В протеомного анализа, белковые идентификации, как правило, достигается с помощью ЖХ-МС/ MS анализ триптических пептидов 6. Белок пищеварение может быть осуществлена с использованием очищенного белка или белков решена путем SDS-PAGE в следующий-гель расщеплением протеаз, таких как трипсин 7-9. Предварительно обогащение смеси белков с помощью SDS-PAGE повышает глубину и точность белка ID. Развитие аналогичных стратегий для glycomic анализа гликопротеина гликозилирования лежит на переднем крае glycoscience.
Два основных класса гликанах крепятся к белковых магистралей через любой N-связи или O-связи. N-связанных гликанов прикреплены к аспарагина (Asn) остатки, найденные в рамках sequon определяется как Asn-X-Ser / Thr / Cys (Х обозначает любую аминокислоту кроме пролина), и может быть выпущен ферментативным расщеплением с пептидные N -glycanase (помощью PNGазы F или), либо в растворе, в-гель, или на 10-12-блота. О-связанных гликаны основном привязаны к серин (Ser) или треонина (Thr) остатков. Тем не менее, только один фермент был идентифицированы, что способна высвобождать О-связанных гликанов из гликопротеина, и это имеет очень ограниченную специфичность гликана, выпуская только самые простые О-связанных гликанов. Стратегии Химическая релиз остаются методом выбора для комплексного выпуска О-связанных гликанов из гликопротеинов. Восстановительное или нередуктивных β-устранение, или гидразинолиз методики хорошо охарактеризованные химической релиз и в настоящее время наиболее часто используемые подходы к выпуская О-связанных гликаны из гликопротеинов 13,14. Хотя восстановительное β-элиминирования был использован, чтобы выпустить О-связанных гликанов из гликопротеинов, разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ, прежние подходы требуется разделение ВЭЖХ для последующего анализа 15-17.
Многомерные MS (MS н) анализ в настоящее время предоставляет богатейший источник структурных данных для определения характеристик гликаны выпущенные из гликопротеинов, выделенных в сумме, от большинства биологических источников. Глубина МС-based структурная характеристика в значительной степени способствует permethylating высвободившиеся гликаны до их анализа. Permethylation усиливает ионизацию и имеет тенденцию к выравниванию молярных ответов сигналов в широком диапазоне гликанов структур 18,19. Кроме того, permethylation однозначно теги терминала и замещенных моносахаридов фрагменты с характерными массами, тем самым повышая структурного анализа 20-23. Например, кислотные гликанов, как правило, трудно обнаружить, как не-перметилированный видов с помощью МС. Хотя кислые гликанов могут быть обнаружены в режиме отрицательных ионов с помощью МС, невозможно обнаруживать как кислых и нейтральных гликанов в том же режиме ионов. Основным преимуществом гликановой permethylation является то, что все количества свободных гидроксильных групп (ОН) на моносахаридных заместителей гликанов будет ограничен метильной группой (ОСН 3 или OMe), таким образом, расходы сиалилированы гликанов являются нейтрализованной, что делает их, как обнаруживается, как перметилированный нейтральный (АзияLO) гликаны. Тем не менее, гидроксильные сульфатных остатков на sulfoglycans устойчивы к permethylation, в результате удержания анионного заряда, который подавляет ионизацию и снижает чувствительность. Это подавление настоящее время препятствует всеобъемлющей glycomic анализ очень сложных гликопротеинов, таких как муцинов, которые несут высокую численность сульфатированных гликанах 24-26.
Последние сообщения на очистных сульфатированный гликанов использовали заряжен, хроматографией с обращенной фазой, чтобы очистить и отдельные перметилированный гликанов до анализа MALDI. Этот метод основан на полном разделении сульфатированных и не сульфатированных гликанах использованием различных подвижных фаз для вымывания, которые мы нашли, чтобы быть менее строгими, чем органическую фазу разделения. Таким образом, новые методы, пригодные для обнаружения и обогащения sulfoglycans представлены здесь. Эти методы позволяют для количественного восстановления сульфатированных гликанов в водной фазе следующим воды: ДХМ (дихлорметан)экстракция, который обычно выполняется в конце гликанов реакций permethylation 27. Важно отметить, что этот надежный разделение перметилированных sulfoglycans из смеси перметилированных не-сульфатированных гликанов одновременно обогащает для заряженных частиц а также упрощение МС 2 модели фрагментации. Комплексный протокол для улучшения вывода связями гликана анализа в геле также представлены. Улучшенный протокол усиливает гликана восстановление, увеличивает структурную информацию, получаемую с помощью MS н анализ перметилированных гликанов, и улучшает чувствительность анализа sulfoglycomic применяемых к основным гликопротеинов, выделенных из биологических источников.
Этот протокол предназначен для O-связанных гликанов анализа целых гликопротеиновых экстрактов или конкретного интереса гликопротеина решена путем SDS-PAGE и состоит из трех экспериментальных процедур; ) Гель очистки, B) в геле восстановительное β-устранение, и C) гликана permethyтельства. Цель состоит в том, чтобы получить всесторонние О-связанных glycomic данные для гликопротеинов, собранного из основных источников биологического интереса (рисунок 1). Гликопротеины разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ которые визуализировали окрашиванием и полосы, представляющие интерес, вырезали и полученный гель полоса нарезанный на небольшие кусочки. Гелевые куски обесцвечивают и подвергали этилацетат промывок для удаления загрязнений гелевые (фиг.2А). Glycan релиз достигается в-гель восстановительного β-элиминирования (рис 2В), а высвобожденные гликаны перметилированный. Водно-органических добыча следующие permethylation количественно разбивает анионные сульфатированной гликаны от не-сульфатированных нейтральных гликанах (рис 2в). В-гель восстановительное β-элиминирования, соединенный с водно-органической экстракции дает характеристику О-связанных гликанов и sulfoglycans освобожденных из небольших количеств гликопротеина разделенных электрофорезом в ДСН-ПААГ. Стратегический обзор является конспектыЗет на рисунке 1 и детали показаны на рисунке 2. Кроме того, часть обесцвечивают и промывают кусочки геля может быть использован для белка ID стандартными LC-MS / MS протеомическим методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
