Förbättrade I-gel Reduktiva β-Eliminering för omfattande O-kopplade och sulfo-glycomics med masspektrometri
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Glykosylering är en viktig protein posttranslationell modifiering, vilket bidrar till organismfysiologi, vävnadspatologi och celligenkännings 1-3. Trots stora framsteg inom analytisk Glycoscience, karakterisera hela mångfalden av glycans på ett specifikt protein fortfarande är ett mycket utmanande uppgift, särskilt på proteiner isolerade från primära biologiska källor. Icke desto mindre mikroheterogenitet av glykoprotein glykanema drabbar ofta funktionella interaktioner med andra proteiner. Därför är en förutsättning för att förstå den fysiologiska betydelsen av cell- och vävnads glykosylering 4,5 karakterisering av glycan mångfald. För att förstå bidrag glykoprotein glykosylering till vävnads fysiologi och patofysiologi, robust, känslig, och omfattande glycomic analystekniken har blivit allt viktigare. I proteomik analys, är protein identifieringar allmänhet genom LC-MS/ MS-analys av tryptiska peptider 6. Protein digestion kan utföras med användning av ett renat protein eller proteiner upplöstes genom SDS-PAGE efter in-gel digestion med proteaser, såsom trypsin 7-9. Pre-anrikning av proteinblandningen genom SDS-PAGE ökar djupet och noggrannhet av protein-ID. Utvecklingen av analoga strategier för glycomic analys av glykoprotein glykosylering ligger i framkant av Glycoscience.
De två huvudklasser av glykaner är knutna till protein stamnät via antingen N-koppling eller O-koppling. N-länkade glykaner är bundna till asparagin (Asn) rester hittades som en del av en sequon definieras såsom Asn-X-Ser / Thr / Cys (X är någon aminosyra förutom prolin), och kan frigöras genom enzymatisk spjälkning med peptid- N -glycanase (PNGasF eller A), antingen i lösning, i-gel eller på-blot 10-12. O-kopplade glykaner är i huvudsak fäst till serin (Ser) eller treonin (Thr) -rester. Dock har endast ett enzym har identifierad som är i stånd att frisätta O-kopplade glykaner från glykoproteinet och den har en extremt begränsad glykan specificitet, endast släppa de enklaste O-kopplade glykaner. Kemisk frigör strategier förblir metoden för omfattande frisättning av O-kopplade glykaner från glykoproteiner. Reduktionistisk eller icke-reduktiv β-eliminering, eller hydrazinolys är väl karakteriserade kemiska släpptekniker och är idag de vanligaste tillvägagångssätten för att frigöra O-kopplade glykaner från glykoproteiner 13,14. Även reduktiv β-eliminering har använts för att släppa O-kopplade glykaner från glykoproteiner separerade med SDS-PAGE, tidigare tillvägagångssätt krävs HPLC-separation för senare analys 15-17.
Multidimensional MS (MS n) analys ger för närvarande den rikaste källan till strukturella uppgifter för att karakterisera glykaner frigörs från glykoproteiner isolerade i de mängder som förväntas av de flesta biologiska källor. Djupet av MSbaserade strukturell karakterisering underlättas i hög grad genom permethylating de frigjorda glykanerna före deras analys. Permetylering ökar jonisering och tenderar att utjämna molar signalsvar över ett brett spektrum av glykanstrukturer 18,19. Dessutom permetylering taggar entydigt terminal- och monosackarid grupper med distinkta massorna, och därigenom förbättra den strukturella belysning 20-23. Till exempel, sura glykaner är generellt svåra att upptäcka som icke-permetylerad arter av MS. Även sura glykaner kan detekteras i negativ jon-läge genom MS, är det omöjligt att upptäcka både sura och neutrala glykaner i samma jon-läget. En stor fördel med glykan permetylering är att alla de fria hydroxylgrupperna (OH) på en glykan s monosackarid substituenter kommer att begränsas med en metylgrupp (OCH3 eller OMe), sålunda är en sialylerade glycan laddningar är neutraliserade, vilket gör dem möjliga att upptäcka som permetylerad neutral (asialo) glykaner. Men hydroxylema av sulfatgrupper på sulfoglycans är resistenta mot permetylering, vilket resulterar i kvarhållande av anjonisk laddning, som undertrycker jonisering och minskar känsligheten. Denna dämpning förhindrar för närvarande omfattande glycomic analys av mycket komplexa glykoproteiner såsom muciner, som bär en hög förekomst av sulfate glycans 24-26.
Nya rapporter om rening av sulfat glykaner använde laddade, omvänd fas-kromatografi för att rena och separera permetylerad glykaner före MALDI analys. Denna metod bygger på fullständig separation av sulfate och icke-sulfate glykaner med olika mobila faser för eluering, som vi har funnit vara mindre stränga än organisk fas partitionering. Därför är nya tekniker som är lämpliga för detektering och anrikning av sulfoglycans presenteras här. Dessa tekniker möjliggör kvantitativ återvinning av sulfate glykaner i vattenfasen efter vatten: DCM (diklormetan)utvinning, som rutinmässigt utförs i slutet av glycan permetylering reaktioner 27. Viktigt är denna robusta separation av permetylerad sulfoglycans från en blandning av permetylerad icke-sulfate glykaner berikar samtidigt för laddade samtidigt förenkla MS 2 fragmenteringsmönster. En omfattande protokoll för förbättrad i-gel O-bunden glykan analys görs också. Den förbättrade protokollet förbättrar glycan återhämtning, ökar strukturell information kan erhållas genom MS n analys av permetylerad glykaner, och förbättrar känsligheten för sulfoglycomic analyser tillämpas på väsentliga glykoproteiner isolerade från biologiska källor.
Detta protokoll är avsedd för O-kopplad glykan analys av hela glykoprotein extrakt eller av ett specifikt glykoprotein av intresse upplöstes genom SDS-PAGE och är sammansatt av tre experimentella procedurer; A) gel sanering, B) i-gel reduktiv β-eliminering, och C) glykan permethyning. Målet är att få heltäckande O-länkad glycomic uppgifter för glykoproteiner som skördats från primära källor av biologiskt intresse (Figur 1). Glykoproteiner separerade med SDS-PAGE visualiseras genom färgning och band av intresse skars ut och den resulterande gelén bandet är skuret i små bitar. Gelén Bitarna avfärgades och utsattes för etylacetat tvättar för att avlägsna gel föroreningar (Figur 2A). Glykanen frisättning uppnås genom i-gel reduktiv β-eliminering (Figur 2B) och de frigjorda glykanema är permetylerad. Vatten-organiskt extraktion enligt permetylering partitioner kvantitativt de anjoniska sulfat glykanema bort från icke-sulfate neutrala glykaner (figur 2C). I-gel reduktiv β-eliminering som är kopplad till vatten-organiskt extraktion möjliggör karakteriseringen av O-kopplade glykaner och sulfoglycans frisatta från små mängder glykoprotein separerades genom SDS-PAGE. Den strategiska översikten är summariZed i figur 1 och detaljerna visas i figur 2. Dessutom kan en del av de avfärgades och tvättade gelstycken användas för protein ID med standard LC-MS / MS proteomik tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
