タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換
Summary
Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.
Abstract
1940透過型電子顕微鏡（TEM）ので、生物学的材料の超高分解能画像で生物を提供している。しかし、理由もアーチファクトのない試料の調製の経験を求めて、面倒で時間がかかるのプロトコルにより、TEMはユーザーフレンドリーな技術とはみなされません。 TEMのための伝統的なサンプル調製は、細胞構造を維持するために化学固定剤を使用した。高圧凍結することにより細胞の超微細構造の完全性に有害な氷の形成を制限し、非常に速い冷却速度を生成するために、高圧下での生体サンプルの低温固定である。高圧凍結し、凍結置換は、現在TEM用樹脂切片における最高品質のモフォロジーを製造するための最適な方法である。これらのメソッドは、通常、薄い切片のTEMのための従来の処理に関連する成果物を最小限に抑えます。低温固定した後、サンプル中の凍結された水が液体で置き換えられる低温での有機溶媒は、プロセスは、凍結置換と呼ばれる。凍結置換は、典型的には、専用の高価な設備で数日間にわたって行われる。最近の技術革新ではなく通常の2日間で、プロセスは3時間で完了することを可能にする。これは、典型的には、浸潤およびセクショニングの前にエポキシ樹脂中に包埋を含む試料調製のいくつかのより多くの日が続く。ここでは、植物試料の固定は時間内で達成されることを可能にする、高圧凍結急速凍結置換を組み合わせたプロトコルを提示する。プロトコルは、容易に他の組織または生物を操作するために適合させることができる。植物組織が原因曝気スペースと水の氷のない凍結を妨げる水で満たされた空胞の存在のために、特別な関心事である。また、化学的固定化のプロセスは、組織内の深いへの化学物質の浸透を妨げ、細胞壁のために、植物では特に長いです。植物組織は、したがって粒子フィルタであるularly挑戦が、このプロトコルは、信頼性があり、最高品質のサンプルを生成する。
Introduction
細胞の超微細構造の私たちの知識は、数ナノメートル1の範囲の内容を解決することができ、電子顕微鏡から主に来る。サンプル調製は時間がかかり、面倒なプロトコルを必要とし、開業医からいくつかの専門知識を要求するように分解能TEMで非常に強力であるにもかかわらず、ユーザーフレンドリーとはみなされません。サンプルの伝統的な固定は、樹脂中に埋め込み、次いで重金属で染色した超薄切片を作製するために切片化、脱水を含むさらなる処理の前に、アルデヒドおよび四酸化オスミウムの使用を組み合わせている。しかしながら、化学的な固定は、最終的にいくつかの細胞区画2に影響を与える膜へのタンパク質凝集及び脂質1の損失、および変更を含むアーティファクトを生成することが知られている。これらのアーティファクトは、主に、室温3、4、5で固定し、脱水の遅い速度に起因する。
<p class="「jove_contentは" ">高圧凍結（HPF）による低温固定は、化学固定によって引き起こされるアーティファクトのほとんどを回避できます。低温固定の原理は、7。HPFが低下し、20度の水の凝固点を低下させる氷結晶の核生成及び成長を遅くし、細胞成分を本質的に6固定されているように、生物学的サンプル中の水の粘度を増大させることであるミリ秒単位の非常に高圧（210 MPa以上2,100バール）の下で、液体窒素とサンプルの温度、。適切に行われると、HPFは、細胞の超微細構造に大きな損傷を引き起こす可能性があり、大きな氷結晶の形成を防止する。 HPFは、生物学的溶質7の典型的な濃度で100〜200ミクロンの厚さのサンプルを固定するために使用することができる。多数の物理学の口コミHPF、 たとえば 1、7,8の基礎となる原則があります。HPF後、試料を低温でインキュベートする（-78.5°C〜-90＆＃176; C）は、一般的に数日間、四酸化オスミウムなどの化学固定剤を含有する液体有機溶媒の存在下で行われる。この低い温度では、サンプル中の水、有機溶媒、典型的にはアセトンまたはメタノール1,9によって置換される。したがって、このプロセスは、凍結置換（FS）と呼ばれている。次いで、試料を次第に温め、この時間の間、通常は四酸化オスミウムおよび酢酸ウラニル9と、固定されている。低温での架橋は1を固定化された分子を固定するという利点を有する。 FSしたがって、改良された超微細構造の保存をもたらし、特に、室温で通常の化学的固定により固定したものに比べて優れた品質、抗原性の良好な保存のサンプルを生成し、未結合の細胞成分10,11の損失を減少させた。
最もFSは、典型的には数日間まで、長期間にわたって行われる。これは、特にトゥルーである植物標本12、13、14の電子。マクドナルドやウェッブによって開発された最近のプロトコルは大幅に数時間から15数日からFSのための時間を削減します。スーパークイックFS（SQFS）でサンプルが90分で処理されている間、それらの急速凍結置換（QFS）手順では、FSは、3時間かけて行われる。これらの方法により作製したサンプルの品質は、従来のFSプロトコルによって得られたものに匹敵する。私たちは、HPF後に植物試料の下流処理のためQFSプロトコルを採用しています。 QFSおよびSQFSではなく、高価な市販のFSマシンの一般的なラボ機器を使用するため、これは、時間だけでなく、お金ではないだけを保存することが証明されています。
植物組織は、多くの場合、TEMの準備をすることは非常に挑戦的である。平均して、植物細胞、細菌細胞または動物細胞のいずれよりも大きくしている。疎水性のワックス状のキューティクル、厚い細胞壁、有機酸、加水分解酵素とフェノールcを含む大きな水で満たされた空胞の存在総細胞体積16の最大90％を占め、曝気スペースの存在は、深刻なシステム17の熱伝導率を低下させることができるompounds。さらに、植物の場合には、試料の厚さは、ほとんどの場合は20μm、化学的固着の使用の制限を超えています。これらの厚さで、水の低い熱伝導率は、サンプルの中心に凍結速度を超える-10,000°C /秒のを防止する。その速度は、有害な六角形の氷の形成（10〜15ナノメートルよりも低い密度と大きな氷結晶）8を回避するために必要とされる。サンプルの適切な凍結およびその後のFSの両方に同時に、これらの課題を提示。それにもかかわらず、低温固定は植物試料を固定するための最良の方法です。ここで植物組織試料のHPF-QFSのためのプロトコルが提示される。これは、モデル種のシロイヌナズナに焦点を当て、またベンサミアナタバコで使用されてきた。典型的な結果は、HPF-QFSはSAを生成することを実証わずかな時間での伝統的なHPF-FSに匹敵する品質のmples。適切な調整で、このプロトコルは、他の比較的厚い生物学的試料のために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するプロトコルの成功は、ユーザーに大きく依存します。まず、先進的な製造は、すべての必要な材料が容易に入手でき、全体のHPF-QFSの実行を完了するのに十分な量であることを保証するために必要とされている。第二に、これにより、ユーザは、組織の天然状態への変更を最小限に抑え、試料の取り扱いを最小限にする効率的な方法でのステップ·ツーステップから移動し、す?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カリフォルニア大学バークレー校の博士ケントマクドナルドの優しさと寛大さが大幅に高く評価されています。私たちは、非常に有用な提案のための匿名査読に感謝します。バーチ·スミスラボは、テネシー大学からのスタートアップ資金によってサポートされています。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch – Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 mL | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
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